Альцгеймер авыруында (AD) протеин биомарклары җитми, аның төп патофизиологиясен чагылдыра, диагностика һәм дәвалау барышына комачаулый. Монда без цереброспиналь сыеклыкны (CSF) биомаркерларны ачыклау өчен комплекслы протеомика кулланабыз, алар AD патофизиологиясенең киң спектрын күрсәтәләр. Мультиплекс масса спектрометриясе якынча 3500 һәм якынча 12,000 аксымны CSF һәм баш миендә ачыклады. Баш ми протеомына челтәр анализы 44 биологик төрлелек модулын чиште, аларның 15е цереброспиналь сыеклык протеомы белән капланган. Бу кабатланучы модульләрдә CSF AD маркерлары биш протеин төркеменә бүлеп, төрле патофизиологик процессларны күрсәтәләр. AD миендәге синапслар һәм метаболитлар кими, ләкин CSF арта, шул ук вакытта глиаль бай миелинация һәм ми һәм CSF иммун төркемнәре арта. Панель үзгәрүләренең эзлеклелеге һәм авырулар үзенчәлеге 500 дән артык өстәмә CSF үрнәкләрендә расланды. Бу төркемнәр шулай ук AD-ның асимптоматик биологик төркемнәрен ачыкладылар. Гомумән алганда, бу нәтиҗәләр веб-нигезләнгән биомаркер коралларына AD-та клиник кушымталар өчен өметле адым.
Альцгеймер авыруы (AD) - бөтен дөньяда нейродженератив деменсиянең иң таралган сәбәбе һәм синоптик тапшыру, глиаль-уртача иммунитет һәм митохондрия метаболизмы кебек биологик система дисфункцияләре белән характерлана. Ләкин, аның урнаштырылган протеин биомарклары әле дә амилоид һәм тау протеинын ачыклауга игътибар итәләр, шуңа күрә бу төрле патофизиологияне чагылдыра алмыйлар. Ereереброспиналь сыеклыкта (CSF) иң ышанычлы үлчәнгән бу "үзәк" протеин биомарклары (i) амилоид бета пептид 1-42 (Aβ1-42), бу корталь амилоид такталарның формалашуын чагылдыра; (ii) гомуми тау, аксон бозылу билгесе; (iii) фоспо-тау (р-тау), патологик тау гиперфосфориляциясе вәкиле (4-7). Бу цереброспиналь сыеклык биомарклары безнең "билгеле" АД белок авыруларын ачыкларга ярдәм итсәләр дә (4-7), алар авыру артындагы катлаулы биологиянең кечкенә өлешен генә күрсәтәләр.
АД биомаркерларының патофизиологик төрлелеге булмау күп проблемаларга китерде, шул исәптән (i) АД пациентларының биологик гетерогенлеген ачыклый һәм саный алмау, (ii) авыруларның авырлыгын һәм үсешен, аеруча преклиник этапта, һәм ( iii) неврологик начарлануның барлык аспектларын тулысынча чишә алмаган терапевтик препаратлар эшләү. Бәйләнешле авырулардан АДны сурәтләү өчен истәлекле патологиягә таянуыбыз бу проблемаларны көчәйтә. Күпчелек дәлилләр шуны күрсәтә: деменсия белән авырган олы кешеләрнең күбесе танып белү төшүенең бердән артык патологик характеристикасына ия (8). АД патологиясе булган кешеләрнең 90% яки аннан да күбрәк кан тамырлары авырулары, TDP-43 инклюзияләре яки башка дегератив авырулар бар (9). Бу патологик капма-каршылыкның югары өлеше деменсия өчен безнең хәзерге диагностик базаны бозды, һәм авыруның тулырак патофизиологик билгеләмәсе кирәк.
Төрле биомаркерларга ашыгыч ихтыяҗны исәпкә алып, кыр биомаркларны табу өчен гомуми системага нигезләнеп "омик" ысулын куллана бара. Тизләтелгән Фармацевтика Партнерлыгы (AMP) -AD Альянсы 2014 елда эшли башлады һәм программаның алгы сафында. Милли Сәламәтлек Институты, академия һәм сәнәгатьнең бу күп дисциплинар тырышлыгы АД патофизиологиясен яхшырак билгеләү һәм биологик төрлелекне диагностик анализлау һәм дәвалау стратегиясен эшләү өчен системалы стратегияләрне куллануны максат итеп куя (10). Бу проект кысаларында челтәр протеомикасы AD-та системага нигезләнгән биомаркерларны алга җибәрү өчен өметле коралга әйләнде. Бу битараф булмаган мәгълүматлы алым катлаулы протеомика мәгълүматларын төркемнәргә яки махсус күзәнәк төрләре, органелллар һәм биологик функцияләр белән бәйләнгән кушылган протеиннарның "модулларын" оештыра (11-13). Мәгълүматка бай челтәр протеомикасы диярлек AD миендә үткәрелгән (13-23). Гомумән, бу анализлар шуны күрсәтә: AD ми челтәре протеомы мөстәкыйль кортларда һәм күп корталь өлкәләрдә бик сакланган модульле оешманы саклый. Моннан тыш, бу модульләрнең кайберләре күп санлы авыруларның патофизиологиясен чагылдырган мәгълүматлар җыелмасы аша AD белән бәйле муллыкта репродуктив үзгәрешләрне күрсәтәләр. Коллектив рәвештә, бу табышмаклар баш ми челтәре протеомын AD-та системага нигезләнгән биомаркер буларак ачу өчен перспективалы якор ноктасын күрсәтәләр.
AD ми челтәре протеомын клиник файдалы системага нигезләнгән биомаркларга әверелдерү өчен, без баш ми челтәрен AD CSF протеом анализы белән берләштердек. Бу интеграль алым CSF биомаркерларының биш перспектив комплектын ачыкларга китерде, алар баш миенә нигезләнгән патофизиология белән бәйле, синапс, кан тамырлары, миелинация, ялкынсыну, метаболик юлларның дисфункциясе. Без бу биомаркер панельләрне берничә репликация анализы аша уңышлы расладык, шул исәптән төрле нейродженератив авырулардан 500 дән артык CSF үрнәкләре. Бу тикшерү анализлары үз эченә асимптоматик АД (АсимАД) булган пациентларның CSF төркемендәге максатларны тикшерүне яки гадәти танып белү мохитендә аномаль амилоид туплануын күрсәтүне үз эченә ала. Бу анализлар АсимАД популярлыгындагы биологик гетерогенлекне күрсәтәләр һәм авыруның иң беренче этапларында шәхесләрне яза алалар. Гомумән алганда, бу нәтиҗәләр күп санлы системаларга нигезләнгән протеин биомаркер коралларын эшкәртүдә төп адым булып тора, алар AD-ның күп клиник проблемаларын уңышлы чишә ала.
Бу тикшерүнең төп максаты - яңа баш мие нигезендәге патофизиологияне чагылдырган яңа цереброспиналь сыеклык биомаркерларын ачыклау. Рәсем S1 безнең тикшеренү методикасын күрсәтә, ул үз эченә ала: сыеклык кортлары. Табышка юнәлтелгән тикшеренүләр 20 танып белү нормаль шәхесендә һәм ЭМори Гойзуета Альцгеймер авыруларын тикшерү үзәгендә (ADRC) CSF дифференциаль экспрессиясен анализлау белән башланды. АД диагнозы түбән Aβ1-42 булганда һәм цереброспиналь сыеклыкта гомуми тау һәм p-tau булганда зур танып белү бозылуы дип билгеләнә [Монреаль танып-белү бәяләү (MoCA), 13,8 ± 7.0] [ELISA (ELISA) )]] (Таблица S1A). Контроль (уртача MoCA, 26,7 ± 2.2) CSF биомаркерларының нормаль дәрәҗәләренә ия иде.
Кеше CSF протеин муллыгының динамик диапазоны белән характерлана, анда альбумин һәм башка бик күп протеиннар кызыклы протеиннарны табуга комачаулый ала (24). Белгеч табу тирәнлеген арттыру өчен, без масса спектрометрия (MS) анализы алдыннан һәр CSF үрнәгеннән беренче 14 бик күп протеинны чыгардык. Барлыгы 39805 пептид MS тарафыннан ачыкланган, алар 40 үрнәктә 3691 протеомга күчерелгән. Протеин күләме күп тандем масса (TMT) маркировкасы белән башкарыла (18, 25). Missingгалган мәгълүматны чишү өчен, без алдагы анализда үрнәкләрнең ким дигәндә 50% күләмендә булган аксымнарны гына керттек, шулай итеп 2875 протеомны санадык. Протеинның гомуми дәрәҗәсенең зур аермасы аркасында, контроль үрнәге статистик яктан чит ил кешесе булып саналды һәм алдагы анализга кертелмәде. Калган 39 үрнәкнең муллык кыйммәтләре яшь, җенес һәм партия ковариансы буенча көйләнде (13-15, 17, 18, 20, 26).
Регрессия мәгълүматлары җыелмасында дифференциаль экспрессияне бәяләү өчен статистик т-тест анализы кулланып, бу анализ контроль һәм АД очраклары арасында муллык дәрәҗәсе сизелерлек үзгәргән белгечләрне ачыклады (таблица S2A). 1А рәсемдә күрсәтелгәнчә, АДда барлыгы 225 аксымның муллыгы сизелерлек кимеде, һәм 303 белок күплеге сизелерлек артты. Бу дифференциаль рәвештә күрсәтелгән протеиннар моңа кадәр ачыкланган цереброспиналь сыеклыкның AD маркерларын үз эченә ала, мәсәлән, микротубул белән бәйле протеин тау (MAPT; P = 3.52 × 10−8), нейрофиламент (NEFL; P = 6.56 × 10−3), үсеш белән бәйле протеин 43 . P = 3.43 × 10−4) һәм VGF нерв үсеш факторы (VGF; P = 4.83 × 10−3) (4-6). Ләкин, без шулай ук бик мөһим максатларны ачыкладык, мәсәлән, ИДП аерылу ингибиторы 1 (GDI1; P = 1.54 × 10-10) һәм SPARC белән бәйле модульле кальций бәйләүче 1 (SMOC1; P = 6.93 × 10-9). Ген онтологиясе (GO) анализы 225 протеинны сизелерлек киметте, стероид метаболизмы, кан коагуляциясе һәм гормон активлыгы кебек тәндәге сыеклык процесслары белән тыгыз бәйләнешне күрсәтте (1Б рәсем һәм S2B таблицасы). Моннан аермалы буларак, 303 протеинның шактый артуы күзәнәк структурасы һәм энергия алмашы белән тыгыз бәйләнгән.
(А) Вулкан сюжеты t-тест белән алынган -log10 статистик P кыйммәтенә (x-күч) лог2 кат үзгәрүен күрсәтә (x-күч), контроль (CT) һәм дифференциаль экспрессияне ачыклау өчен кулланыла. CSF протеомының барлык очраклары. БРда сизелерлек кимегән протеиннар (П <0.05) зәңгәр төстә, ә авыру дәрәҗәсе сизелерлек арткан аксымнар кызыл төстә күрсәтелә. Сайланган протеин билгеле. Б) Протеин белән бәйле иң яхшы GO терминнары сизелерлек кимиләр (зәңгәр) һәм реклама (кызыл). Биологик процесслар, молекуляр функцияләр һәм кәрәзле компонентлар өлкәсендә иң югары z-балллары булган өч GO терминын күрсәтә. (C) MS CSF үрнәгендә MAPT дәрәҗәсен үлчәде (сулда) һәм аның ELISA тау дәрәҗәсе (уңда) үрнәге белән бәйләнеше. Пирсон корреляция коэффициенты тиешле P кыйммәте белән күрсәтелә. Бер AD очраклары өчен ELISA мәгълүматлары булмаганлыктан, бу саннар анализланган 39 очракның 38енә кыйммәтләр кертә. (D) Күзәтелгән кластер анализы (П <0.0001, Бенжамини-Хохберг (BH) контрольдә P <0.01) көйләнде һәм AD CSF мәгълүматлар җыелмасында иң мөһим үзгәртелгән 65 протеин кулланып үрнәкләр тапты. Стандартлаштыру, нормальләштерү.
MAPT протеомик дәрәҗәсе мөстәкыйль үлчәнгән ELISA тау дәрәҗәсе белән тыгыз бәйләнгән (r = 0.78, P = 7.8 × 10-9; рәсем 1C), безнең MS үлчәүнең дөреслеген хуплый. Амилоид прекурсор протеины (АПП) дәрәҗәсендә трипсин ашатылганнан соң, Aβ1-40 һәм Aβ1-42 C-терминусына ясалган изоформа специфик пептидлары эффектив ионлаштырыла алмый (27, 28). Шуңа күрә, без билгеләгән APP пептидларының ELISA Aβ1-42 дәрәҗәләре белән бернинди бәйләнеше юк. Caseәрбер очракның дифференциаль чагылышын бәяләү өчен, без үрнәкләргә күзәтелгән кластер анализы ясау өчен P <0.0001 [ялган ачыш тизлеге (FDR) төзәтелгән P <0.01] белән дифференциаль белдерелгән аксымнар кулландык. 1-нче рәсемдә күрсәтелгәнчә, бу 65 бик әһәмиятле аксымнар үрнәкләрне авыру торышы буенча дөрес кластерлый алалар, контроль охшаш характеристикалары булган бер АД очракларыннан кала. Бу 65 протеинның 63е б.з.да арткан, икесе генә (CD74 һәм ISLR) кимегән. Гомумән алганда, бу цереброспиналь сыеклык анализы б. Э.
Аннары без баш ми протеомына бәйсез челтәр анализы ясадык. Бу ачышның баш миенә дорсолацион префронталь кортекс (DLPFC) контроль (n = 10), Паркинсон авыруы (PD; n = 10), катнаш AD / PD (n = 10) һәм AD (n = 10) очраклары кертелгән. ) Ampleрнәк. Эмери Гойзуета ADRC. Бу 40 очракның демографикасы элек тасвирланган (25) һәм S1B таблицасында кыскача әйтелә. Без бу 40 ми тукымасын һәм 27 очракның репликация когортын анализлау өчен TMT-MS кулландык. Гомумән алганда, бу ике ми мәгълүмат җыелмасы 227,121 уникаль пептид җитештерде, алар 12 943 протеомга күчерелде (25). Соңгы тикшерүләргә ким дигәндә 50% очракларда саналган протеиннар гына кертелгән. Соңгы ачыш мәгълүматлары җыелмасында 8817 санлы протеиннар бар. Протеинның муллык дәрәҗәсен яшь, җенес һәм үлгәннән соң интервал (PMI) нигезендә көйләгез. Регрессиядән соң куелган мәгълүматларга дифференциаль экспресс анализы күрсәтте:> 2000 протеин дәрәҗәсе сизелерлек үзгәрде [P <0.05, вариант анализы (ANOVA)] ике яки күбрәк авыру кортында. Аннары, без дифференциаль рәвештә күрсәтелгән протеиннар нигезендә күзәтелгән кластер анализы ясадык, һәм P <0.0001 AD / контроль һәм / яки AD / PD чагыштыруларында (Рәсем S2, A һәм B, S2C таблицасы). Бу 165 югары үзгәртелгән протеиннар контроль һәм ПД үрнәкләреннән AD патологиясе булган очракларны ачык итеп сурәтлиләр, бөтен протеомдагы AD-специфик үзгәрешләрне раслыйлар.
Аннары без ачылган ми протеомы буенча челтәр анализы ясау өчен, авырлыктагы Ген Ко-Экспресс Челтәр Анализы (WGCNA) алгоритмын кулландык, ул протеин модулларына охшаган мәгълүматны охшаш белдерү үрнәкләре белән оештыра (11-13). Анализ 44 модульне (M) берләштерелгән протеиннарны ачыклады, сортланган һәм иң зурыннан (M1, n = 1821 протеин) иң кечкенәсенә кадәр (M44, n = 34 белок) (2A рәсем һәм S2D таблицасы). Aboveгарыда әйтелгәнчә (13) eachәрбер модульнең вәкиллекле профилен яки характерлы протеинын санагыз, һәм аны авыру торышы һәм АД патологиясе белән бәйләгез, ягъни Альцгеймер авырулары реестры (CERAD) һәм Braak Score (2Б рәсем). Гомумән алганда, 17 модуль AD нейропатологиясе белән бик нык бәйләнгән (П <0.05). Бу авырулар белән бәйле модульләрнең күбесе күзәнәк тибындагы маркерларга бай (2Б рәсем). Aboveгарыда әйтелгәнчә (13), күзәнәк тибын баету модульнең каплануын һәм күзәнәк тибындагы геннарның белешмә исемлеген анализлау белән билгеләнә. Бу геннар тычкан нейроннарында, эндотелия һәм глиаль күзәнәкләрдә бастырылган мәгълүматлардан алынган. РНК эзләү (RNA-seq) эксперименты (29).
А) Баш ми протеомының WGCNAын табыгыз. (B) Ике авырлыктагы урта корреляция (BiCor) модульле имза протеинына (модульле протеин экспрессының беренче төп компоненты) AD нейропатологик характеристикалары (өстә), шул исәптән CERAD (Aβ тактасы) һәм Браак (тау танглары) баллары. Позитив (кызыл) һәм тискәре (зәңгәр) корреляцияләрнең интенсивлыгы ике төсле җылылык картасы белән күрсәтелә, һәм йолдызлар статистик әһәмиятне күрсәтәләр (П <0.05). Proteinәр белок модулының күзәнәк тибындагы ассоциациясен бәяләү өчен гипергеометрик балыкчының төгәл сынавын (FET) кулланыгыз. Кызыл күләгәнең интенсивлыгы күзәнәк тибын баету дәрәҗәсен күрсәтә, һәм йолдызлык статистик әһәмиятне күрсәтә (П <0.05). FH-тан алынган P кыйммәтен төзәтү өчен BH ысулын кулланыгыз. (C) Модульле протеиннарга GO анализы. Иң тыгыз бәйләнгән биологик процесслар һәр модуль яки бәйләнешле модуль төркеме өчен күрсәтелә. олиго, олигодендроцит.
Астроцитлар һәм микроглиягә бай биш модульләр җыелмасы (M30, M29, M18, M24, M5) AD нейропатологиясе белән көчле уңай бәйләнеш күрсәттеләр (2Б рәсем). Онтология анализы бу глиаль модульләрне күзәнәк үсеше, таралу һәм иммунитет белән бәйли (Рәсем 2C һәм таблица S2E). Ике өстәмә глиаль модуль, M8 һәм M22, шулай ук авыруларда нык көйләнәләр. M8 Түләүгә охшаган рецепторлар юлы белән бик бәйләнгән, тумыштан килгән иммун реакциядә төп роль уйный торган сигнал каскады (30). Шул ук вакытта, M22 тәрҗемәдән соңгы модификация белән тыгыз бәйләнгән. Олигодендроцитларга бай M2, АД патологиясе һәм нуклеозид синтезы һәм ДНК репликасы белән онтологик бәйләнеш күрсәтә, бу авыруларда күзәнәкләрнең таралуын күрсәтә. Гомумән, бу табышмаклар без элек AD челтәр протеомында күзәткән глиаль модульләрнең күтәрелүен хуплый (13, 17). Хәзерге вакытта челтәрдәге күпчелек AD белән бәйле глиаль модульләр контрольдә һәм ПД очракларында түбән күрсәткеч дәрәҗәсен күрсәтәләр, аларның авыру үзенчәлеген күрсәтәләр (AD S2C).
Безнең челтәр протеомындагы дүрт модуль (M1, M3, M10, һәм M32) AD патологиясе белән бик тискәре бәйләнештә тора (П <0.05) (2 нче рәсем, В һәм С). М1 дә, М3 да нейрон маркерларына бай. M1 синаптик сигналлар белән бик бәйләнгән, ә M3 митохондрия функциясе белән тыгыз бәйләнгән. M10 һәм M32 өчен күзәнәк тибын баету турында бернинди дәлил дә юк. M32 M3 белән күзәнәк метаболизмы арасындагы бәйләнешне чагылдыра, ә M10 күзәнәк үсеше һәм микротубул функциясе белән бик бәйләнгән. АД белән чагыштырганда, дүрт модуль дә контрольдә һәм ПДда көчәйтелә, аларга авыруларга хас AD үзгәрүләрен бирә (Рәсем S2C). Гомумән алганда, бу нәтиҗәләр нейронга бай модульләрнең кимүен хуплый, без моңа кадәр б. Э. (13, 17). Йомгаклап әйткәндә, без ачкан ми протеомының челтәр анализы безнең алдагы ачышларыбызга туры китереп AD-махсус үзгәртелгән модульләр җитештерде.
Реклама башлангыч асимптоматик этап белән аерылып тора (АсимАД), анда кешеләр амилоид туплануны клиник танып белү кимүеннән күрсәтәләр (5, 31). Бу асимптоматик этап иртә ачыклау һәм интервенция өчен критик тәрәзәне күрсәтә. Элегерәк без мөстәкыйль мәгълүматлар җыелмасы аша AsymAD һәм AD ми челтәре протеомының көчле модульле саклануын күрсәттек (13, 17). Хәзерге вакытта без ачкан ми челтәренең алдагы ачышларга туры килүен тәэмин итү өчен, без 27 DLPFC оешмасының күчерелгән мәгълүматларында 44 модульнең саклануын анализладык. Бу оешмаларга контроль (n = 10), AsymAD (n = 8) һәм AD (n = 9) очраклары керә. Контроль һәм AD үрнәкләре безнең ачыш ми когортына анализ ясадылар (таблица S1B), ә AsymAD очраклары репликация когортында гына уникаль иде. Бу AsymAD очраклары Emory Goizueta ADRC ми банкыннан да килгән. Deathлем вакытында танып белү нормаль булса да, амилоид дәрәҗәсе гадәти булмаган (CERAD, 2,8 ± 0,5) (таблица S1B).
Бу 27 ми тукымасына TMT-MS анализы 11244 протеом күләменә китерде. Бу соңгы санау үрнәкләрнең ким дигәндә 50% күләмендә булган протеиннарны гына үз эченә ала. Бу күчерелгән мәгълүматлар җыелмасында безнең ачыш ми анализында ачыкланган 8817 аксымның 8638 (98,0%) бар, һәм контроль һәм AD когортлары арасында 3000гә якын аксым үзгәрде (П <0.05, Тукайның параллель анализыннан соң). Таблица S2F). Бу дифференциаль рәвештә күрсәтелгән протеиннар арасында 910 шулай ук AD һәм ми протеомы белән идарә итү очраклары арасында зур дәрәҗәдәге үзгәрешләр күрсәтте (П <0.05, ANOVA Tukey парлы т-тесттан соң). Әйтергә кирәк, бу 910 маркерлар протеомнар арасында үзгәрү юнәлешендә бик эзлекле (r = 0.94, P <1.0 × 10-200) (S3A рәсем). Артырган протеиннар арасында, мәгълүматлар җыелмасы арасында иң эзлекле үзгәрешләр булган протеиннар, нигездә, глиаль бай M5 һәм M18 модульләре әгъзалары (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1, GFAP). Кыскартылган протеиннар арасында, иң эзлекле үзгәрешләр булганнар, синапс белән бәйләнгән M1 модулының (NPTX2, VGF, RPH3A) әгъзалары диярлек. Алга таба без AD-белән бәйле мидкин (MDK), CD44, яшерен суытылган протеин 1 (SFRP1) һәм VGF көнбатыш шартлаулары белән тикшердек (S3B рәсем). Модульне саклау анализы күрсәткәнчә, ми протеомындагы протеин модульләренең (34/44) якынча 80% реплика мәгълүматлар җыелмасында сакланган (z-score> 1.96, FDR P <0.05 төзәтелгән) (S3C рәсем). Бу модульләрнең ундүртесе ике протеом арасында махсус сакланган (z-score> 10, FDR P <1.0 × 10−23 төзәткән). Гомумән алганда, ми протеомы арасында дифференциаль экспрессиядә һәм модульле составта югары эзлеклелекне табу һәм кабатлау AD фронталь кортекс белгечләренең үзгәрүенең репродуктивлыгын күрсәтә. Моннан тыш, ул шулай ук AsymAD һәм тагын да алдынгы авыруларның ми челтәре структурасына охшаш булуын раслады.
Баш ми репликацияләү мәгълүматлар җыелмасындагы дифференциаль экспрессны җентекләп анализлау AsymAD белок үзгәрүенең зур дәрәҗәсен күрсәтә, шул исәптән АсимАД һәм контроль арасында барлыгы 151 сизелерлек үзгәргән аксымнар (P <0.05) (С3Д рәсем). Амилоид йөге белән эзлекле, AsymAD һәм AD миендәге APP сизелерлек артты. MAPT AD-ның сизелерлек үзгәрә, тангларның арту дәрәҗәсенә туры килә һәм танып белү төшүе белән билгеле корреляциягә туры килә (5, 7). Глиальга бай модульләр (M5 һәм M18) АсимАДта үскән аксымнарда бик зур чагылыш таба, ә нейрон белән бәйле M1 модуле АсимАДта кимегән аксымнарның иң вәкиле. Бу AsymAD маркерларының күбесе симптоматик авыруларда зуррак үзгәрешләр күрсәтәләр. Бу маркерлар арасында SMOC1, M18ныкы булган глиаль протеин бар, ул баш ми шешләре һәм күз һәм аяк үсеше белән бәйле (32). MDK - күзәнәк үсеше һәм ангиогенез (33) белән бәйле гепарин бәйләүче үсеш факторы, M18ның тагын бер әгъзасы. Контроль төркем белән чагыштырганда, AsymAD сизелерлек артты, аннан соң AD-ның зур үсеше. Киресенчә, синаптик белок нейропентраксин 2 (NPTX2) AsymAD миендә сизелерлек кимеде. NPTX2 моңа кадәр нейродженерация белән бәйләнгән һәм дулкынландыргыч синапсларны арадаш итүдә танылган рольгә ия (34). Гомумән алганда, бу нәтиҗәләр авыруның авырлыгы белән алга киткән кебек тоелган төрле преклиник протеин үзгәрешләрен ачыклый.
Баш мие протеомын ачканда без протеинны каплауның тирәнлегенә ирешкәнебезне исәпкә алып, без аның челтәр дәрәҗәсендәге AD транскриптомы белән тулысынча охшашлыгын аңларга тырышабыз. Шуңа күрә, без ачкан баш ми протеомын без элек AD (n = 308) һәм контроль (n = 157) DLPFC тукымалары (13) микроаррей үлчәвеннән ясалган модуль белән чагыштырдык. кабатлану. Гомумән алганда, без 20 төрле РНК модулын ачыкладык, аларның күбесе нейроннар, олигодендроцитлар, астроцитлар һәм микроглия кебек аерым күзәнәк төрләрен баетуны күрсәттеләр (3A рәсем). Бу модульләрнең AD-ның күп үзгәреше 3-нче рәсемдә күрсәтелгән. Элеккеге протеин-РНК өстәмә анализы белән эзлекле, тирән язылмаган MS протеомы (якынча 3000 протеин) (13) кулланып, без тапкан ми протеом челтәрендәге 44 модульнең күбесе транскриптом челтәрендә. Монда бернинди дә охшашлык юк. баш ми протеомында югары сакланган 34 белок модулын табу һәм кабатлау, Фишерның төгәл сынавыннан (FET) бары тик 14 (~ 40%) транскриптом белән статистик әһәмияткә ия булуын раслады (3A рәсем). ДНК зарарларын ремонтлау (P-M25 һәм P-M19), протеин тәрҗемәсе (P-M7 һәм P-M20), РНК бәйләү / бүлү (P-M16 һәм P-M21) һәм протеинга каршы (P-M13 һәм P-) туры килә. M23) транскриптомдагы модульләр белән капланмый. Шуңа күрә, хәзерге капма-каршы анализда (13) тирәнрәк протеом мәгълүматлар җыелмасы кулланылса да, AD челтәр протеомының күпчелеге транскриптом челтәренә кертелмәгән.
(А) Гипергеометрик FET күзәнәк тибындагы маркерларны AD транскриптомының (өске) РНК модулында баетуны һәм РНК (х-күч) һәм АД миенең протеин (у-күч) модуллары арасындагы охшашлык дәрәҗәсен күрсәтә. (аста). Кызыл күләгәнең интенсивлыгы өске панельдәге күзәнәк төрләрен баету дәрәҗәсен һәм аскы панельдәге модульләрнең кабатлану интенсивлыгын күрсәтә. Йолдызлыклар статистик әһәмиятне күрсәтәләр (П <0.05). Б) transәр транскриптом модулының характерлы геннары һәм AD статусы арасындагы корреляция дәрәҗәсе. Сул яктагы модульләр AD (зәңгәр) белән иң тискәре корреляцияләнгән, һәм уң якта AD (кызыл) белән иң уңай корреляцияләнгән. Бүрәнә үзгәртелгән BH төзәтелгән P бәясе һәр корреляциянең статистик әһәмиятен күрсәтә. (C) Уртак күзәнәк тибын баету белән бик күп кабатланган модульләр. (D) Бер-берсенә каршы торган модульдә протеин (х-күч) һәм РНК (у-күч) лог2 кат үзгәрүенең корреляцион анализы. Пирсон корреляция коэффициенты тиешле P кыйммәте белән күрсәтелә. Микро, микроглия; күк җисемнәре, астроцитлар. КТ, контроль.
Күпчелек кабатланган протеин һәм РНК модульләре охшаш күзәнәк тибын баету профильләрен һәм эзлекле AD үзгәртү юнәлешләрен бүлешәләр (3 нче рәсем, В һәм С). Башка сүзләр белән әйткәндә, баш мие протеомының синапс белән бәйле M1 модуле (PM 1) өч нейронга бай гомологик РНК модулына күчерелгән (R-M1, R-M9 һәм R-M16), алар ADда булганнар. кимегән дәрәҗә. Нәкъ шулай ук, глиаль бай M5 һәм M18 белок модульләре астроцитларга һәм микроглиаль маркерларга бай РНК модульләре белән капланалар һәм авыруларда катнашалар. Ике мәгълүмат җыелмасы арасындагы бу уртак модульле үзенчәлекләр күзәнәк тибын баетуны һәм без баш мие протеомында күзәткән авырулар белән бәйле үзгәрешләрне тагын да ныгыта. Ләкин, без бу уртак модульләрдә РНК һәм аерым маркерларның протеин дәрәҗәсе арасында бик күп аерманы күзәттек. Бу кабатланучы модульләр эчендәге молекулаларның протеомикасы һәм транскриптомикасының дифференциаль чагылышына корреляцион анализ бу туры килмәүне күрсәтә. Мәсәлән, APP һәм тагын берничә глиаль модуль белгечләре (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1, һәм SFRP1) AD протеомының сизелерлек артуын күрсәттеләр, ләкин AD транскриптомында үзгәрешләр юк диярлек. Бу протеинга хас булган үзгәрешләр амилоид такталар белән тыгыз бәйләнештә булырга мөмкин, протеомны патологик үзгәрешләр чыганагы итеп күрсәтә, һәм бу үзгәрешләр транскриптомда чагылмаска мөмкин.
Без ачкан ми һәм CSF протеомнарын мөстәкыйль анализлагач, без баш ми челтәренең патофизиологиясе белән бәйле AD CSF биомаркерларын ачыклау өчен ике мәгълүмат җыелмасына комплекслы анализ ясадык. Без башта ике протеомның охшашлыгын билгеләргә тиеш. CSF AD миендәге нейрохимик үзгәрешләрне чагылдыруы киң кабул ителсә дә, AD мие белән CSF протеомы арасында төгәл охшашлык билгеле түгел. Ике протеомда табылган уртак ген продуктлары санын чагыштырып, без цереброспиналь сыеклыкта ачыкланган аксымнарның якынча 70% (n = 1936) мидә дә санланганын ачыкладык (4A рәсем). Бу капма-каршы протеиннарның күбесе (n = 1721) баш ми мәгълүматлары җыелмасыннан 44 уртак модульнең берсенә күчерелгән (4Б рәсем). Көтелгәнчә, алты иң зур ми модуле (M1 - M6) иң зур күләмдә CSF охшашлыгын күрсәттеләр. Шулай да, кечерәк ми модуллары бар (мәсәлән, M15 һәм M29), алар көтелмәгән югары дәрәҗәгә ирешәләр, баш ми модулыннан ике тапкыр зуррак. Бу безне ми белән цереброспиналь сыеклык арасындагы каплануны исәпләү өчен тагын да җентеклерәк, статистик ысул белән кулланырга этәрә.
(А һәм В) Ачыклау миендә һәм CSF мәгълүматлары бер-берсенә охшаш. Бу бер-берсенә охшаган протеиннарның күбесе ми ко-экспрессия челтәренең 44 ко-экспрессия модулының берсе белән бәйле. (C) ereереброспиналь сыеклык протеомы һәм баш ми челтәре протеомы арасындагы охшашлыкны ачыклагыз. Heatылылык картасының һәр рәте гипергеометрик FETның аерым кабатлану анализын күрсәтә. Rowгары рәттә ми модуле һәм бөтен CSF протеомы арасындагы капма-каршы (соры / кара күләгә) сурәтләнә. Икенче юлда ми модуллары һәм CSF протеины (кызыл төстә күләгәле) арасындагы охшашлык ADда (P <0.05) сизелерлек көйләнә. Өченче рәт шуны күрсәтә: баш мие модульләре һәм CSF протеины (зәңгәр күләгә) арасындагы охшашлык ADда бик түбән көйләнгән (P <0.05). FH-тан алынган P кыйммәтен төзәтү өчен BH ысулын кулланыгыз. (D) Күзәнәк тибындагы ассоциация һәм аңа бәйле GO терминнары нигезендә катлау модул панели. Бу панельләрдә барлыгы 271 ми белән бәйле протеиннар бар, алар CSF протеомында дифференциаль белдерүгә ия.
Бер койрыклы FET кулланып, без CSF протеомы һәм аерым ми модуллары арасында протеинның каплануының мөһимлеген бәяләдек. Анализ ачыклаганча, CSF мәгълүматлар җыелмасында барлыгы 14 ми модуле статистик яктан әһәмиятле охшашлыкларга ия (FDR көйләнгән P <0.05), һәм өстәмә модуль (M18) бер-берсенә охшашлыгы мөһим (FDR көйләнгән P = 0.06) (4C рәсем) , өске рәт). Без шулай ук дифференциаль рәвештә күрсәтелгән CSF белгечләре белән ныклап капланган модульләр белән кызыксынабыз. Шуңа күрә, без ике өстәмә FET анализы кулландык, (i) CSF протеинының кайсысы ADда сизелерлек арткан һәм (ii) CSF протеины ADда сизелерлек кимегән (P <0.05, парлы тест AD / контроль) Ми модульләре мәгънәле охшашлык белән. арасында. 4C рәсемнең урта һәм аскы рәтләрендә күрсәтелгәнчә, бу өстәмә анализлар шуны күрсәтә: 44 ми модулының 8е AD CSF кушылган протеин белән шактый охшаш (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33, M38) . ), ә ике модуль (M6 һәм M15) AD CSF-та кимегән протеин белән мәгънәле охшашлыкны күрсәттеләр. Көтелгәнчә, барлык 10 модуль 15 модульдә, CSF протеомы белән иң югары охшаш. Шуңа күрә, без бу 15 модульнең баш миеннән алынган CSF биомаркерларының югары уңышлы чыганаклары дип уйлыйбыз.
WGCNA агач схемасындагы якынлыгы һәм күзәнәк төрләре һәм ген онтологиясе белән бәйләнешенә карап, без бу 15 кабатланучы модульне биш зур протеин панеленә тупладык (4D рәсем). Беренче панельдә нейрон маркерларына һәм синапс белән бәйле протеиннарга бай модульләр бар (M1 һәм M12). Синаптик панельдә барлыгы 94 протеин бар, һәм CSF протеомындагы дәрәҗәләр сизелерлек үзгәрде, һәм бу биш панель арасында ми белән бәйле CSF маркерларының иң зур чыганагы булды. Икенче төркем (M6 һәм M15) эндотелия күзәнәк маркерлары һәм кан тамырлары белән тыгыз бәйләнешне күрсәттеләр, мәсәлән, "яраны дәвалау" (M6) һәм "юмористик иммун реакцияне көйләү" (M15). M15 шулай ук липопротеин метаболизмы белән бик бәйләнгән, ул эндотелия белән тыгыз бәйләнгән (36). Тамыр панелендә баш миенә бәйле 34 CSF маркеры бар. Өченче төркемгә олигодендроцит маркерлары һәм күзәнәкләр таралуы белән бәйле булган модульләр (M2 һәм M4) керә. Мәсәлән, M2-ның иң югары дәрәҗәдәге онтология терминнары "ДНК репликасын уңай көйләү" һәм "пурин биосинтез процессы". Шул ук вакытта M4 эчендә "глиаль күзәнәк дифференциациясе" һәм "хромосома сегрегациясе" бар. Миелинация панелендә баш миенә бәйле 49 CSF маркеры бар.
Дүртенче төркемдә иң модульләр бар (M30, M29, M18, M24, һәм M5), һәм барлык модульләр диярлек микроглия һәм астроцит маркерларына бик бай. Миелинация панеленә охшаган дүртенче панельдә шулай ук күзәнәкләр таралуы белән тыгыз бәйләнгән модульләр бар (M30, M29, M18). Бу төркемдәге бүтән модульләр иммунологик терминнар белән бик бәйләнгән, мәсәлән, "иммун эффект процессы" (M5) һәм "иммун реакцияне көйләү" (M24). Глиаль иммун төркемендә баш миенә бәйле 42 CSF маркеры бар. Ниһаять, соңгы панельдә дүрт модульдә (M44, M3, M33, M38) 52 ми белән бәйле маркерлар бар, һәммәсе организмда энергия саклау һәм метаболизм белән бәйле. Бу модульләрнең иң зуры (M3) митохондрия белән тыгыз бәйләнгән һәм нейронга хас маркерларга бай. M38 - бу метаболомада кечерәк модуль әгъзаларының берсе, шулай ук уртача нейрон үзенчәлеген күрсәтә.
Гомумән алганда, бу биш панель AD кортексындагы күзәнәк төрләренең һәм функцияләренең киң спектрын чагылдыра, һәм бергәләп 271 ми белән бәйле CSF маркерларын үз эченә ала (S2G таблицасы). Бу MS нәтиҗәләренең дөреслеген бәяләү өчен, без мультиплексинг мөмкинлекләре, югары сизгерлек һәм спецификасы булган ортогональ антитела технологиясен якынлаштыру киңәйтү анализын кулландык, һәм цереброспиналь сыеклык үрнәкләрен реанализацияләдек, бу 271 биомаркерның бер өлешен таптык. (n = 36). Бу 36 максат безнең MS нигезендәге табышмаклар белән тыгыз бәйләнгән PEA-ның AD күптөрлелеген күрсәтә, бу безнең комплекслы MS анализ нәтиҗәләрен нык раслаган (S4 рәсем) ).
Синаптик сигналдан алып энергия метаболизмасына кадәр безнең биш төркем ассызыклаган биологик темалар барысы да АД патогенезы белән бәйле (1-3). Шуңа күрә, бу панельләрне үз эченә алган 15 модульнең барысы да без ачкан ми протеомындагы АД патологиясе белән бәйле (2Б рәсем). Иң күренеклесе - безнең глиаль модульләр арасында иң зур уңай патологик корреляция һәм иң зур нейрональ модульләр арасында көчле тискәре патологик корреляция (M1 һәм M3). Күчерелгән ми протеомына дифференциаль экспресс анализы (рәсем S3D) шулай ук M5 һәм M18-дан алынган глиаль аксымнарны күрсәтә. AsymAD һәм симптоматик АДда глиаль аксымнар һәм M1 белән бәйле синапслар Иң күп кими. Бу күзәтүләр шуны күрсәтә: без биш төркемдә билгеләгән 271 цереброспиналь сыеклык маркерлары АД кортексындагы авыру процесслары белән бәйле, шул исәптән эре асимптоматик этапларда.
Баш миендәге һәм умыртка сыеклыгында панель белгечләренең үзгәрү юнәлешен яхшырак анализлау өчен, без 15 кабатланучы модульнең һәрберсенә түбәндәгеләрне ясадык: (i) ми мәгълүматлар җыелмасында модульнең муллык дәрәҗәсен һәм (ii) модульне таптык. протеин Аерма цереброспиналь сыеклыкта күрсәтелә (С5 рәсем). Алда әйтелгәнчә, WGCNA модульнең күплеген яки баш миендәге характерлы протеин кыйммәтен билгеләү өчен кулланыла (13). Вулкан картасы цереброспиналь сыеклыкта (AD / контроль) модульле аксымнарның дифференциаль чагылышын сурәтләү өчен кулланыла. Бу саннар шуны күрсәтә: биш панельнең өчесе мидә һәм умыртка сыеклыгында төрле белдерү тенденцияләрен күрсәтә. Синапс панельнең ике модуле (M1 һәм M12) AD миендәге муллык дәрәҗәсенең кимүен күрсәтәләр, ләкин AD CSFдагы протеинның артуы белән сизелерлек охшаш (S5A рәсем). Метаболоманы (M3 һәм M38) үз эченә алган нейрон белән бәйле модульләр охшаш ми һәм цереброспиналь сыеклыкның экспресс-формаларының туры килмәвен күрсәттеләр (S5E рәсем). Тамыр панели шулай ук төрле белдерү тенденцияләрен күрсәтте, гәрчә аның модульләре (M6 һәм M15) AD миендә уртача артканнар һәм авыру CSF кимегәннәр (S5B рәсем). Калган ике панельдә зур глиаль челтәрләр бар, аларның протеиннары ике бүлектә дә эзлекле көйләнә (S5, C һәм D).
Зинһар, онытмагыз, бу тенденцияләр бу панельдәге барлык маркерлар өчен гадәти түгел. Мәсәлән, синаптик панельдә AD миендә һәм CSFда сизелерлек кимегән берничә протеин бар (S5A рәсем). Бу түбән көйләнгән цереброспиналь сыеклык маркерлары арасында NPTX2 һәм M1 VGF, һәм M12 хромогранины бар. Ләкин, бу очракларга карамастан, безнең синаптик маркерларның күбесе умыртка сөягендә күтәрелә. Гомумән, бу анализлар безнең биш панельнең һәрберсендә баш мие һәм цереброспиналь сыеклык дәрәҗәсенең статистик әһәмиятле тенденцияләрен аера алды. Бу тенденцияләр баш мие һәм CSF белок экспрессиясе арасындагы катлаулы һәм еш төрле бәйләнешне күрсәтәләр.
Аннары, без 271 биомарклар җыелмасын иң перспективалы һәм репродуктив максатларга таркату өчен, югары дәрәҗәдәге MS репликация анализын кулландык (CSF репликасы 1). CSF 1 күчермәсендә Emory Goizueta ADRC-ның барлыгы 96 үрнәге бар, алар арасында контроль, AsymAD һәм AD когорт (S1A таблицасы). Бу реклама очраклары йомшак танып белү төшүе белән аерылып тора (уртача MoCA, 20.0 ± 3,8), һәм цереброспиналь сыеклыкта расланган AD биомаркерларының үзгәрүе (таблица S1A). Без тапкан CSF анализыннан аермалы буларак, бу репликация тагын да эффектив һәм югары үткәргечле "бер ату" MS ысулы ярдәмендә башкарыла (оффлайн фракциясез), шул исәптән аерым үрнәкләрнең иммунодеплеция кирәклеген бетерә торган гадиләштерелгән үрнәк әзерләү протоколы. . Киресенчә, аз протеиннар сигналын көчәйтү өчен бер иммун-тузган "көчәйтү каналы" кулланыла (37). Протеомның гомуми каплануын киметсә дә, бу бер тапкыр ату ысулы машина вакытын сизелерлек киметә һәм тормышка ашырыла торган анализ ясарга мөмкин булган TMT маркалы үрнәкләр санын арттыра (17, 38). Гомумән алганда, анализ 6487 пептидны ачыклады, алар 96 очракта 1,183 протеомга туры килде. CSF анализы кебек, без үрнәкләрнең ким дигәндә 50% күләмендә булган протеиннар гына киләсе исәпләүләргә кертелде, һәм мәгълүмат яшь һәм җенес эффектлары өчен регрессияләнде. Бу 792 протеомның соңгы санына китерде, аларның 95% табылган CSF мәгълүматлар җыелмасында да ачыкланды.
(А) Баш ми белән бәйле CSF белок максатлары беренче күчерелгән CSF когортында расланган һәм соңгы панельгә кертелгән (n = 60). (B - E) Панель биомаркер дәрәҗәләре (составлы z-баллар) дүрт CSF репликация кортында үлчәнәләр. Парлы т-тестлар яки Тукайның коррекциядән соң ANOVA һәр реплика анализында муллык үзгәрүләренең статистик әһәмиятен бәяләү өчен кулланылды. КТ, контроль.
Без аеруча 271 ми белән бәйле CSF максатларыбызны комплекслы анализ аша тикшерү белән кызыксынабыз, шуңа күрә без бу кабатланган протеомны алга таба тикшерүне чикләячәкбез. Бу 271 белок арасында 100 CSF репликасында табылды 1. С6А рәсемендә контроль һәм AD репликация үрнәкләре арасында бу 100 кабатланучы маркерларның дифференциаль чагылышы күрсәтелә. Синаптик һәм метаболит гистоннары б. Э. 100 кабатланган маркерларның күбесе (n = 70) ике мәгълүмат җыелмасында бер үк үзгәрү юнәлешен саклап калдылар (С6Б рәсем). Бу 70 ми белән бәйле расланган CSF маркерлары (таблица S2H) күбесенчә алдан күзәтелгән панель экспрессия тенденцияләрен чагылдыра, ягъни кан тамырлары белгечләренең түбән көйләнеше һәм бүтән панельләрнең көйләнеше. Бу 70 расланган протеинның 10ы гына бу панель тенденцияләренә каршы килгән AD муллыгында үзгәрешләр күрсәтте. Баш миенең һәм цереброспиналь сыеклыкның гомуми тенденциясен иң яхшы чагылдырган панель булдыру өчен, без бу 10 белокны без кызыксынган панельдән чыгардык (5A рәсем). Шуңа күрә, безнең панель ахыр чиктә төрле үрнәк әзерләү һәм MS платформа анализы ярдәмендә ике бәйсез CSF AD кортында расланган барлыгы 60 протеинны үз эченә ала. CSF копия 1 контролендә һәм соңгы очракларда бу соңгы панельләрнең z-балл экспресс сюжетлары без тапкан CSF когортында күзәтелгән панель тенденциясен расладылар (5Б рәсем).
Бу 60 протеин арасында, остеопонтин (SPP1) кебек, АД белән бәйле булган молекулалар бар, бу бик күп тикшеренүләрдә (39-41), һәм GAP43, синаптик белок. нейродженерация белән ачык бәйләнгән (42). Иң тулы расланган протеиннар - башка нейродженератив авырулар белән бәйле маркерлар, мәсәлән, амиотрофик латаль склероз (ALS) белән бәйле супероксид дисмутаз 1 (SOD1) һәм Паркинсон авыруы белән бәйле десахараз (PARK7). Без шулай ук күп маркерларның, мәсәлән, SMOC1 һәм мигә бай мембраналар сигнализациясе белок 1 (BASP1), нейродженерация белән элеккеге бәйләнешләренең чикләнгәнлеген тикшердек. Әйтергә кирәк, CSF протеомында аларның гомуми күплеге аркасында, MAPTны һәм башка AD белән бәйле аксымнарны ышанычлы ачыклау өчен, бу югары үткәргечле бер тапкыр ату ысулын куллану кыен. (Мисал өчен, NEFL һәм NRGN ) (43, 44).
Аннары без бу 60 өстенлекле панель маркерларын өч өстәмә реплика анализында тикшердек. CSF Copy 2-дә без 297 контроль һәм Emory Goizueta ADRC (17) -тан алынган бәйсез когортны анализлау өчен бер TMT-MS кулландык. CSF 3 репликасы 120 контрольдән булган TMT-MS мәгълүматларына һәм Лозанна, Швейцариядән AD пациентларына реанализ кертте (45). Eachәрбер мәгълүматлар базасында 60 өстенлекле маркерның өчтән икесен таптык. Швейцария тикшеренүләре төрле MS платформаларын һәм TMT санлаштыру ысулларын куллансалар да, без панель тенденцияләрен ике тапкыр анализладык (5 нче рәсем, С һәм Д, һәм S2, I, J таблицалары). Төркемебезнең авыру үзенчәлеген бәяләү өчен, без TMT-MS кулландык, дүртенче репликация мәгълүматлар җыелмасын анализлау өчен (CSF репликация 4), алар контроль (n = 18) һәм AD (n = 17) очракларын гына түгел, ә PD ( n = 14)), ALS (n = 18) һәм фронтотемпораль деменсия (FTD) үрнәкләре (n = 11) (S1A таблицасы). Бу когорттагы панель белгечләренең өчтән ике өлешен уңышлы санадык (60ның 38е). Бу нәтиҗәләр барлык биш биомаркер панельдә AD-специфик үзгәрешләрне күрсәтәләр (5E рәсем һәм S2K таблицасы). Метаболит төркеменең артуы иң көчле AD үзенчәлеген күрсәтте, аннары миелинация һәм глиаль төркем. Азрак дәрәҗәдә, FTD шулай ук бу панельләр арасындагы артуны күрсәтә, алар челтәрнең охшаш потенциаль үзгәрешләрен чагылдыра ала (17). Киресенчә, ALS һәм PD контроль төркем белән бер үк миелинация, глиаль һәм метаболома профильләрен күрсәттеләр. Гомумән алганда, үрнәк әзерләү, MS платформасы, һәм TMT санлаштыру ысулларының аермаларына карамастан, бу кабатланган анализлар безнең өстенлекле панель маркерларның 500-дән артык уникаль CSF үрнәкләрендә AD-специфик үзгәрешләрнең югары эзлекле булуын күрсәтәләр.
AD нейродженерациясе танып белү симптомнары башланганчы берничә ел элек танылды, шуңа күрә AsymAD биомаркларына ашыгыч ихтыяҗ бар (5, 31). Ләкин, тагын да күбрәк дәлилләр шуны күрсәтә: AsymAD биологиясе бер тигез түгел, һәм рискның һәм ныклыкның катлаулы үзара бәйләнеше алдагы авырулар үсешендә зур аермаларга китерә (47). AsymAD очракларын ачыклау өчен кулланылса да, төп CSF биомаркерларның дәрәҗәләре (Aβ1-42, гомуми тау һәм p-tau) деменсиягә кемнең алга китәчәген ышанычлы алдан әйтә алмаулары исбатланмады (4, 7), бу күбрәк булырга мөмкин. Бу халыкның куркынычын төгәл катлауландыру өчен, баш ми физиологиясенең берничә аспектына нигезләнгән гомуми биомаркер коралларын кертергә кирәк. Шуңа күрә, без CSF күчермәсенең AsymAD популярлыгында безнең AD-расланган биомаркер панелен анализладык. Бу 31 AsymAD очраклары аномаль үзәк биомаркер дәрәҗәсен күрсәттеләр (Aβ1–42 / гомуми ELISA коэффициенты, <5.5) һәм тулы танып белү (MoCA, 27.1 дигәнне аңлата); ± 2.2) (таблица S1A). Моннан тыш, AsymAD булган барлык кешеләрнең дә клиник деменсия баллы 0 бар, бу көндәлек танып белү яки функциональ күрсәткечнең кимүенә бернинди дәлил дә юклыгын күрсәтә.
Без башта 96 CSF репликасында расланган панельләрнең дәрәҗәләрен анализладык, шул исәптән AsymAD когортын. АсимАД төркемендәге берничә панельнең AD шикелле муллык үзгәрүләре булганын ачыкладык, тамыр панели AsymADда төшү тенденциясен күрсәтте, калган панельләр өскә күтәрелү тенденциясен күрсәттеләр (6A рәсем). Шуңа күрә барлык панельләр ELISA Aβ1-42 һәм гомуми тау дәрәҗәләре белән бик мөһим корреляция күрсәттеләр (6Б рәсем). Киресенчә, төркем белән MoCA балл арасындагы бәйләнеш чагыштырмача начар. Бу анализлардан иң гаҗәеп табышмакларның берсе - AsymAD когортындагы панель муллыгы. 6A рәсемдә күрсәтелгәнчә, AsymAD төркеменең панель дәрәҗәсе гадәттә контроль төркемнең һәм AD төркеменең панель дәрәҗәсен уза, чагыштырмача югары үзгәрүчәнлекне күрсәтә. АсимАДның бу гетерогенлыгын тагын да күбрәк тикшерү өчен, без күп үлчәмле масштаб (MDS) анализын кулландык, 96 CSF репликасы 1 очракта. MDS анализы мәгълүматлар җыелмасындагы кайбер үзгәрүчәннәргә нигезләнгән очраклар арасындагы охшашлыкны күз алдына китерергә мөмкинлек бирә. Бу кластер анализы өчен, без CSF ачышында һәм 1 протеом (n = 29) (S2L таблицасы) дәрәҗәсендә статистик яктан мөһим үзгәрешләр булган (P <0.05, AD / контроль) расланган панель маркерларын кулланабыз. Бу анализ безнең контроль һәм АД очраклары арасында ачык киңлек кластеры ясады (6-нчы рәсем). Моннан аермалы буларак, кайбер AsymAD очраклары контроль төркемдә ачыкланган, калганнары AD очракларында урнашкан. Бу AsymAD гетерогенлыгын тагын да күбрәк тикшерү өчен, без MDS картасын кулланып, бу AsymAD очракларының ике төркемен билгеләдек. Беренче төркемгә AsymAD очраклары кертелгән, контрольгә якынрак (n = 19), икенче төркем AsymAD очраклары белән характерланган, маркер профиле AD (n = 12) белән якынрак.
(А) CSF биомаркер төркеменең белдерү дәрәҗәсе (z-балл), CSF репликасы 1 когорттагы барлык 96 үрнәктә, шул исәптән AsymAD. Тукайның коррекциядән соңгы вариантына анализ панель муллыгы үзгәрүләренең статистик әһәмиятен бәяләү өчен кулланылды. (B) Панель протеиннарының муллык дәрәҗәсенә (z-балл) корреляцион анализ, ELISA Aβ1-42 һәм CSF күчермәләренең 1 үрнәге. Пирсон корреляция коэффициенты тиешле P кыйммәте белән күрсәтелә. (C) 96 CSF копиясенең MDS 1 очраклары 29 расланган панель маркерларының муллык дәрәҗәсенә нигезләнде, алар ачышта да, CSF күчермәсендә дә 1 мәгълүмат җыелмасы [P <0.05 AD / control (CT)]. Бу анализ AsymAD төркемен контроль (n = 19) һәм AD (n = 12) төркемчәләренә бүлү өчен кулланылды. (D) Вулкан сюжеты барлык CSF репликасы 1 протеинның дифференциаль чагылышын күрсәтә, log2 тапкыр үзгәрү (x-күч) белән, ике AsymAD төркемчәсе арасында -log10 статистик P кыйммәтенә караганда. Панель биомарклар төсле. (E) CSF репликасы биомаркларның сайлап алу төркеменең 1 муллык дәрәҗәсе AsymAD төркемчәләре арасында дифференциаль рәвештә күрсәтелә. Тукайның варианттан соң көйләнгән анализы статистик әһәмиятне бәяләү өчен кулланылды.
Без бу контроль һәм AD кебек AsymAD очраклары арасында дифференциаль протеин экспрессиясен тикшердек (6D рәсем һәм S2L таблицасы). Нәтиҗә ясалган вулкан картасы шуны күрсәтә: ике панель маркеры ике төркем арасында сизелерлек үзгәрде. Бу маркерларның күбесе синапс һәм метаболома әгъзалары. Шулай да, миелин һәм глиаль иммун төркемнәре әгъзалары булган SOD1 һәм миристойлатланган аланинга бай белок киназ С субстраты (MARCKS) да бу төркемгә керәләр (6-нчы рәсем, Д һәм Е). Тамыр панели шулай ук AD маркалы AsymAD төркемендә сизелерлек кимегән ике маркерны кертте, шул исәптән AE бәйләүче протеин 1 (AEBP1) һәм C9 гаилә әгъзасын тулыландыручы. ELISA AB1-42 (P = 0.38) һәм p-tau (P = 0.28) белән идарә итү һәм AD шикелле AsymAD төркемчәләре арасында зур аерма юк иде, ләкин чыннан да гомуми тау дәрәҗәсендә зур аерма бар иде (P = 0.0031) ) (С7 рәсем). Ике AsymAD төркемчәләре арасындагы үзгәрешләр гомуми тау дәрәҗәләренә караганда мөһимрәк булуын күрсәтүче берничә панель маркерлары бар (мәсәлән, YWHAZ, SOD1, MDH1) (6E рәсем). Гомумән алганда, бу нәтиҗәләр шуны күрсәтә: безнең расланган панельдә биомарклар булырга мөмкин, алар асимптоматик авыру булган пациентларның тип төрен һәм потенциаль стратегияләштерә ала.
АД артындагы төрле патофизиологияне яхшырак үлчәү һәм максат итү өчен системага нигезләнгән биомаркер коралларына ашыгыч ихтыяҗ бар. Бу кораллар безнең АД диагностик базасын үзгәртеп кенә калмыйча, эффектив, пациентларга хас дәвалау стратегияләрен кулланырга ярдәм итәрләр дип көтелә (1, 2). Бу максаттан, без баш миенә нигезләнгән патофизиологиянең киң спектрын чагылдырган веб-нигезләнгән CSF биомаркерларын ачыклау өчен, AD миенә һәм CSFга бертигез комплекслы протеомика алымын кулландык. Безнең анализ биш CSF биомаркер панель ясады, алар (i) синапсларны, кан тамырларын, миелинны, иммун һәм метаболик дисфункцияне чагылдыралар; (ii) төрле MS платформаларында көчле репродуктивлыкны күрсәтү; (iii) эраның беренче һәм соңгы этапларында авыруларга хас үзгәрешләрне күрсәтегез. Гомумән алганда, бу табышмаклар AD тикшеренүләре һәм клиник кушымталар өчен төрле, ышанычлы, веб-юнәлешле биомаркер коралларын үстерү өчен өметле адымны күрсәтәләр.
Безнең нәтиҗәләр AD ми челтәре протеомының бик сакланган оешмасын күрсәтәләр һәм аны системага нигезләнгән биомаркер үсеше өчен якорь итеп куллануны хуплыйлар. Безнең анализ шуны күрсәтә: AD һәм AsymAD ми булган ике бәйсез TMT-MS мәгълүматлар базасы көчле модульлеккә ия. Бу табышмаклар фронталь, париеталь һәм вакытлыча кортексдагы берничә мөстәкыйль корттан 2000-дән артык ми тукымасының көчле модульләрен саклап калуны күрсәтеп, алдагы эшебезне киңәйтәләр (17). Бу консенсус челтәре хәзерге тикшеренүләрдә күзәтелгән төрле авырулар белән бәйле үзгәрешләрне чагылдыра, шул исәптән глиаль бай ялкынсыну модулларының артуы һәм нейронга бай модульләрнең кимүе. Хәзерге тикшеренүләр кебек, бу зур масштаблы челтәр дә АсимАДта зур модульле үзгәрешләр күрсәтә, төрле преклиник патофизиологияне күрсәтә (17).
Ләкин, бу бик консерватив система нигезендә, аеруча бөртекле биологик гетерогенлек бар, аеруча б. Э. Безнең биомаркер панель AsymADда ике төркемчәне сурәтли ала, алар күп CSF маркерларының дифференциаль чагылышын күрсәтәләр. Безнең төркем бу ике төркем арасында биологик аерманы күрсәтә алды, алар AD биомарклары дәрәҗәсендә күренми иде. Контроль төркем белән чагыштырганда, бу AsymAD шәхесләренең Aβ1-42 / гомуми тау дәрәҗәсе гадәти булмаган. Ләкин, ике AsymAD төркемчәсе арасында гомуми тау дәрәҗәләре генә аерылып тордылар, ә Aβ1-42 һәм p-tau дәрәҗәләре чагыштырмача чагыштырырлык булып калдылар. CSгары CSF тау танып белү симптомнарын Aβ1-42 дәрәҗәсенә караганда яхшырак фаразлый кебек (7), шуңа күрә без ике AsymAD кортының авыру үсешенең төрле куркынычлары булырга мөмкин дип шикләнәбез. Безнең AsymAD-ның чикләнгән үрнәк күләмен һәм озын мәгълүматларның булмавын исәпкә алып, бу нәтиҗәләрне ышаныч белән ясау өчен алга таба тикшеренүләр кирәк. Ләкин, бу нәтиҗәләр шуны күрсәтә: системага нигезләнгән CSF панели авыруның асимптоматик этабында кешеләрне эффектив катламлаштыру сәләтебезне көчәйтә ала.
Гомумән, безнең ачышлар АД патогенезында берничә биологик функциянең ролен хуплый. Ләкин, дискрегуляцияләнгән энергия алмашы безнең биш расланган маркировкалау панельләренең төп темасы булды. Гипоксантин-гуан фосфорибосилтрансферасы 1 (HPRT1) һәм лактат дегидроэназ А (LDHA) кебек метаболик протеиннар иң көчле расланган синаптик биомарклар, бу AD CSF үсешенең югары репродуктив секс булуын күрсәтә. Безнең кан тамырлары һәм глиаль панельләр шулай ук оксидиатив матдәләр алмашында катнашкан берничә маркерны үз эченә ала. Бу табышмаклар метаболик процессларның бөтен мидә уйнаган төп роленә туры килә, нейроннарның югары энергия ихтыяҗын канәгатьләндерү өчен генә түгел, ә астроцитларның һәм башка глиаль күзәнәкләрнең югары энергия ихтыяҗын канәгатьләндерү өчен (17, 48). Безнең нәтиҗәләр нәтиҗәләре редокс потенциалының үзгәрүе һәм энергия юлларының өзелүе АД патогенезында катнашкан берничә төп процесс арасында төп бәйләнеш булырга мөмкин, шул исәптән митохондрия бозулары, глиаль-уртача ялкынсыну, кан тамырлары зарарлыгы (49). Моннан тыш, метаболик цереброспиналь сыеклык биомаркерлары безнең контроль һәм AD шикелле AsymAD төркемчәләре арасында бик күп дифференциаль бай протеиннарны үз эченә ала, бу энергиянең һәм редокс юлларының өзелүе авыруның преклиник этабында критик булырга мөмкинлеген күрсәтә.
Без күзәткән төрле ми һәм цереброспиналь сыеклык панель тенденцияләре кызыклы биологик тәэсиргә дә ия. Нейроннарга бай синапслар һәм метаболомалар AD миендәге дәрәҗәләрнең кимүен һәм цереброспиналь сыеклыкның муллыгын күрсәтәләр. Нейроннарның синапсларда энергия җитештерүче митохондриягә бай булуын исәпкә алып, аларның күп санлы махсус сигналларын энергия белән тәэмин итү өчен (50), бу ике нейрон төркеменең экспресс профильләренең охшашлыгы көтелә. Нейроннарның югалуы һәм зарарланган күзәнәкләрнең экструзиясе бу ми һәм CSF панель тенденцияләрен соңрак авыру белән аңлатырга мөмкин, ләкин алар без күзәткән беренче панель үзгәрешләрен аңлатып бирә алмыйлар (13). Иртәге асимптоматик авыруларда бу табышмакларның бер аңлатмасы - аномаль синаптик юу. Тычкан модельләрендәге яңа дәлилләр шуны күрсәтә: микроглия-арадаш синаптик фагоцитоз ADда гадәти булмаган рәвештә активлашырга һәм баш миендә синапсның югалуына китерергә мөмкин (51). Бу ташланган синаптик материал CSFда тупланырга мөмкин, шуңа күрә без нейрон панельдә CSF үсешен күзәтәбез. Иммун-арадаш синаптик юу шулай ук без баш миендә күзәткән глиаль аксымнарның һәм цереброспиналь сыеклыкның үсүен өлешчә аңлатырга мөмкин. Синаптик юу белән беррәттән, экзоцитик юлдагы гомуми аномальлекләр шулай ук төрле мигә һәм CSF нейрон маркерларына китерергә мөмкин. Берничә тикшеренүләр күрсәткәнчә, АД миенең патогенезындагы экзозоматларның эчтәлеге үзгәргән (52). Класстан тыш юл Aβ таралуда катнаша (53, 54). Әйтергә кирәк, экзосомаль секрецияне бастыру AD трансгеник тычкан модельләрендә АД сыман патологияне киметергә мөмкин (55).
Шул ук вакытта, кан тамырлары панелендәге протеин AD миенең уртача үсешен күрсәтте, ләкин CSFда сизелерлек кимеде. Кан-ми барьеры (BBB) дисфункциясе бу табышмакларны өлешчә аңлатырга мөмкин. Күпчелек мөстәкыйль постмортем тикшеренүләре безнең эраның BBB таркалуын күрсәтте (56, 57). Бу тикшеренүләр эндотелия күзәнәкләренең тыгыз мөһерләнгән катламы тирәсендәге төрле аномаль чараларны расладылар, шул исәптән баш мие капиллярлары агып чыгу һәм канлы аксымнарның периваскуляр туплануы (57). Бу баш миендәге кан тамырлары протеиннары өчен гади аңлатма бирә ала, ләкин цереброспиналь сыеклыктагы шул ук аксымнарның бетүен тулысынча аңлатып бирә алмый. Мөгаен, үзәк нерв системасы ялкынсыну һәм оксидиатив стресс проблемасын чишү өчен бу молекулаларны актив рәвештә изоляцияли. Бу панельдәге иң каты CSF аксымнарының кимүе, аеруча липопротеин көйләүдә катнашучылар, зарарлы ялкынсыну дәрәҗәләрен тыю һәм реактив кислород төрләренең нейропротектив процессы белән бәйле. Бу пароксоназ 1 (PON1) өчен дөрес, әйләнештә оксидиатив стресс дәрәҗәсен киметү өчен җаваплы липопротеин бәйләүче фермент (58, 59). Альфа-1-микроглобулин / бикунин прекурсоры (AMBP) - тамыр төркеменең тагын бер түбән көйләнгән маркеры. Бу липид ташучы бикунин прекурсоры, ул шулай ук ялкынсынуны басуда һәм неврологик саклауда катнаша (60, 61).
Төрле кызыклы гипотезаларга карамастан, биохимик авыру механизмнарын турыдан-туры таба алмау - ачышка нигезләнгән протеомика анализының билгеле чикләнеше. Шуңа күрә, бу биомаркер панельләр артындагы механизмнарны ышаныч белән билгеләү өчен алга таба тикшеренүләр кирәк. MS нигезендәге клиник анализ үсешенә күчү өчен, киләчәк юнәлеш шулай ук сайлап алынган яки параллель реакция мониторингы кебек зур масштаблы биомаркер тикшерү өчен максатчан санлы ысуллар куллануны таләп итә (62). Күптән түгел без параллель реакция мониторингын кулландык (63), монда тасвирланган күпчелек CSF белок үзгәрешләрен раслау өчен. Берничә өстенлекле панель максатлары YWHAZ, ALDOA, һәм SMOC1 кебек төгәл төгәллек белән бәяләнәләр, алар безнең синапс, метаболизм һәм ялкынлану панельләренә карта ясыйлар (63). Бәйсез мәгълүмат туплау (DIA) һәм MS нигезендәге башка стратегияләр дә максатчан тикшерү өчен файдалы булырга мөмкин. Буд һ.б. (64) Күптән түгел күрсәтелде, безнең CSF ачыш мәгълүматлары җыелмасында билгеләнгән AD биомарклары белән бәйсез DIA-MS мәгълүматлар җыелмасы арасында зур охшашлык, өч төрле Европа кортыннан 200гә якын CSF үрнәгеннән торган. Бу соңгы тикшеренүләр безнең панельләрнең ышанычлы MS нигезендә ачыклауга әйләнү потенциалын хуплый. Традицион антитела һәм аптамерга нигезләнгән ачыклау шулай ук төп биомаркерларның алга таба үсеше өчен мөһим. CSF аз булу сәбәпле, бу биомаркларны югары үткәрүчән MS ысуллары ярдәмендә табу кыенрак. NEFL һәм NRGN - аз муллык CSF биомаркерларының шундый ике мисалы, алар безнең комплекслы анализда панельгә күчерелгән, ләкин безнең бердәм MS стратегиябез ярдәмендә ышанычлы табылмый. PEA кебек күп антителаларга нигезләнгән стратегияләр, бу маркерларның клиник үзгәрүен алга этәрергә мөмкин.
Гомумән алганда, бу тикшеренү төрле системалар нигезендә CSF AD биомаркерларын ачыклау һәм тикшерү өчен уникаль протеомика алымы тәкъдим итә. Өстәмә AD кортлары һәм MS платформалары аша бу маркер панельләрен оптимальләштерү AD рискларын стратификацияләү һәм дәвалауны алга җибәрергә өметле булырга мөмкин. Вакыт узу белән бу панельләрнең озынлык дәрәҗәсен бәяләгән тикшеренүләр шулай ук маркерларның кайсы комбинациясенең иртә авыру куркынычын һәм авыру авырлыгының үзгәрүен ачыклау өчен бик мөһим.
CSF тарафыннан күчерелгән 3 үрнәктән кала, бу тикшерүдә кулланылган барлык CSF үрнәкләре Emory ADRC яисә тыгыз бәйләнешле тикшеренү институтлары ярдәмендә җыелган. Бу протеомика тикшеренүләрендә барлыгы дүрт комплект Emory CSF үрнәкләре кулланылды. CSF когортында 20 сәламәт контроль һәм 20 АД пациентыннан үрнәкләр барлыгы ачыкланды. CSF 1 күчермәсендә 32 сәламәт контроль, 31 AsymAD шәхес һәм 33 AD шәхесләре үрнәкләре бар. CSF 2 күчермәсендә 147 контроль һәм 150 AD үрнәкләре бар. Күп авыру CSF репликасы 4 когортка 18 контроль, 17 AD, 19 ALS, 13 PD, 11 FTD үрнәге кертелгән. Эмори Университетының Институциональ күзәтү советы белән расланган килешү буенча, Emory өйрәнүендә катнашучыларның барысы да рөхсәт алдылар. Альцгеймер үзәкләре өчен иң яхшы тәҗрибә күрсәтмәләре буенча 2014 Милли Институты (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html) нигезендә цереброспиналь сыеклык ломбард тешләү белән җыелган һәм сакланган. Контроль һәм AsymAD һәм AD пациентлары Emory Cognitive Neurology Clinic яки Goizueta ADRC стандартлаштырылган танып-белү бәясен алдылар. Аларның цереброспиналь сыеклык үрнәкләре INNO-BIA AlzBio3 Luminex тарафыннан ELISA Aβ1-42, гомуми тау һәм p-tau анализы өчен сынадылар (65). ELISA кыйммәтләре билгеләнгән биомаркерның критерийларына нигезләнеп предметларның диагностик классификациясен куллану өчен кулланыла (66, 67). Башка CSF диагностикалары өчен төп демографик һәм диагностик мәгълүматлар (FTD, ALS, PD) шулай ук Emory ADRC яки бәйләнешле тикшеренү институтларыннан алынган. Бу Emory CSF очраклары өчен кыскача мета-мәгълүматлар S1A таблицасында табылырга мөмкин. Швейцария CSF репликасының 3 когорт характеристикалары моңа кадәр бастырылган (45).
CSF үрнәк тапты. CSF мәгълүматлар җыелмасын ачуыбызның тирәнлеген арттыру өчен, трипсинизация алдыннан югары мул протеиннарның иммун куллануы башкарылды. Кыскасы, 40 индивидуаль CSF үрнәгеннән 130 μл CSF һәм тигез күләмдә (130 μл) югары сайлау Top14 муллык протеинының бетү резинасы (Термо Фишер Фәнни, A36372) бүлмәдә әйләнү баганасына урнаштырылды (Термо Фишер Фәнни, A89868). температура инкубат). 15 минут әйләнгәннән соң, үрнәкне 1000г 2 минутта центрифуга. 3К ультрацентрифугаль фильтр җайланмасы (Миллипор, UFC500396) агып чыккан үрнәкне центрифуга белән 30 минут эчендә концентрацияләү өчен кулланылды. Барлык үрнәк күләмнәрен фосфат буферланган тоз белән 75 μлга эретегез. Протеин концентрациясе җитештерүче протоколы (Термо Фишер Фәнни) нигезендә бикинхонин кислотасы (BCA) ысулы белән бәяләнде. Иммунодеплетланган CSF (60 μл) барлык 40 үрнәкләрдән дә лизил эндопептидасы (LysC) һәм трипсин белән ашатылды. Кыскасы, үрнәк 1,2 μл 0,5 М трис-2 (-карбоксиетил) -фосфин һәм 3 μл 0,8 М хлороацетамид белән 90 минутта 10 минут эчендә киметелде һәм 15 минут эчендә су мунчасында ясалды. Ampleрнәк 193 μл 8 М карбамид буферы белән эретелгән (8 М карбамид һәм 100 мм NaHPO4 (pH 8.5)] 6 М карбамидның соңгы концентрациясенә кадәр. LysC (4,5 μг; Вако) бүлмә температурасында төнлә ашкайнату өчен кулланыла. Аннары үрнәк 1 мм карбамидка 50 мм аммиак биарбонаты (ABC) белән эретелде (68). Трипсинга (Промега) тигез күләмдә (4,5 μг) кушыгыз, аннары үрнәкне 12 сәгать инкубацияләгез. Эшкәртелгән пептид эремәсен 1% форм кислотасы (ФА) һәм 0,1% трифлуорацетик кислотасы (TFA) (66) концентрациясенә кислоталагыз, аннары югарыда күрсәтелгәнчә 50 мг Sep-Pak C18 баганасы белән сусызландырыгыз (25) . Аннары пептид 1 мл 50% ацетонитрилда (ACN) чыгарылды. Партияләр (25) буенча протеин күләмен стандартлаштыру өчен, барлык 40 CSF үрнәкләреннән 100 μл аликотлар катнаш үрнәк булдыру өчен берләштерелде, аннары биш глобаль эчке стандарт (GIS) (48) үрнәгенә бүленде. Барлык индивидуаль үрнәкләр һәм берләштерелгән стандартлар югары тизлекле вакуум белән киптерелә (Labconco).
CSF үрнәкне күчерә. Дейон һәм хезмәттәшләре моңа кадәр иммунның бетүен һәм CSF копиясенең 3 үрнәген ашатуны тасвирладылар (45, 46). Калган реплика үрнәкләре аерым иммунодеплетланмаган. Алдан әйтелгәнчә, бу күчерелмәгән үрнәкләрне трипсинда табыгыз (17). Eachәрбер кабатланган анализ өчен, һәр үрнәктән алынган 120 μл аликотлары бергә тупланды һәм тигез күләмле аликотларга бүленде, TMT маркалы глобаль эчке стандарт (48). Барлык индивидуаль үрнәкләр һәм берләштерелгән стандартлар югары тизлекле вакуум белән киптерелә (Labconco). Аз муллык CSF белок сигналын көчәйтү өчен, һәр үрнәктән 125 μл кушып, һәр реплика анализы өчен “көчәйтелгән” үрнәк әзерләнде [ягъни, тикшеренү үрнәгенә охшаган биологик үрнәк, ләкин булган күләм бар күпкә зуррак (37, 69)] катнаш CSF үрнәгенә кушылды (17). Аннан соң катнаш үрнәк 12 мл High Select Top14 муллык протеинын чыгару резинасы (Термо Фишер Фәнни, A36372) ярдәмендә иммуноремизацияләнде, югарыда әйтелгәнчә сеңдерелде һәм соңрак берничә TMT маркировкасына кертелде.
Пост вакыты: 27-2021 август