Nature.com сайтына кергәнегез өчен рәхмәт. Сез кулланган браузер версиясендә CSS ярдәме чикләнгән. Иң яхшы тәҗрибә өчен без яңартылган браузерны кулланырга киңәш итәбез (яки Internet Explorer'та туры килү режимын сүндерегез). Шул ук вакытта, дәвамлы ярдәмне тәэмин итү өчен, без сайтны стильләр һәм JavaScriptсыз күрсәтәчәкбез.
Термофиллар - югары температурада үсә торган микроорганизмнар. Аларны өйрәнү тормышның экстремаль шартларга ничек яраклашуы турында кыйммәтле мәгълүмат бирә ала. Ләкин гадәти оптик микроскоплар белән югары температура шартларына ирешү кыен. Localирле резистив электр җылытуга нигезләнгән берничә өйдә эшләнгән карарлар тәкъдим ителде, ләкин гади коммерция чишелеше юк. Бу кәгазьдә без термофил тикшеренүләре өчен югары температураны тәэмин итү өчен, микроскоп лазер җылыту төшенчәсен тәкъдим итәбез, кулланучының мохитен йомшак тотып. Урта лазер интенсивлыгында микроскаль җылыту алтын нанопартик белән капланган субстратны биокомпонентлы һәм эффектив яктылык үзләштергеч ярдәмендә ирешеп була. Микроскаль сыеклык конвекциясенең, күзәнәкләрне тотуның, центрифугааль термофоретик хәрәкәтнең мөмкин эффектлары карала. Бу ысул ике төрдә күрсәтелде: (i) Geobacillus stearothermophilus, актив термофил бактерия, якынча 65 ° C тәэсирендә, без микроскаль җылыту астында үсәргә, үсәргә һәм йөзәргә күзәттек; (ii) Тиобасилл сп., оптималь гипертермофил археа. 80 ° C. Бу эш заманча һәм арзан микроскопия коралларын кулланып термофилик микроорганизмнарны гади һәм куркынычсыз күзәтү өчен юл ача.
Миллиардлаган еллар дәвамында onирдәге тормыш әйләнә-тирә мохит шартларына яраклашу өчен үсеш алды, алар кайвакыт безнең караштан экстремаль санала. Аерым алганда, термофил дип аталган кайбер термофилик микроорганизмнар (бактерияләр, археа, гөмбәләр) 45 ° C дан 122 ° C1, 2, 3, 4. температура диапазонында үсәләр. Термофиллар төрле экосистемаларда яшиләр, тирән диңгез гидротермик вентлары, кайнар чишмәләр. яки вулкан өлкәләре. Аларның тикшеренүләре соңгы берничә дистә елда ким дигәндә ике сәбәп аркасында зур кызыксыну уятты. Беренчедән, без алардан, мәсәлән, 5, 6, 7, 8 ферментлары һәм 9 мембраналар ничек шундый югары температурада тотрыклы булуларын, яки термофилларның радиациянең экстремаль дәрәҗәләренә ничек каршы тора алуларын өйрәнә алабыз10. Икенчедән, алар бик күп биотехнологик кушымталар өчен нигез булып торалар, 11,12, ягулык җитештерү кебек 13,14,15,16, химик синтез (диhидро, спиртлар, метан, аминокислоталар һ.б.) 17, биомининг18 һәм термосток биокаталистлар7, 11, 13. Аерым алганда, хәзерге вакытта танылган полимераз чылбыр реакциясе (PCR) 19 термофил бактериясеннән изоляцияләнгән ферментны (Так полимераз) үз эченә ала, беренче термофилларның берсе.
Ләкин, термофилларны өйрәнү җиңел эш түгел һәм бернинди биологик лабораториядә дә импровизация ясап булмый. Аерым алганда, термофилларны витрода бернинди стандарт яктылык микроскопы белән күзәтеп булмый, хәтта коммерцияле җылыту камералары булса да, гадәттә 40 ° C температура өчен бәяләнә. 1990-нчы еллардан башлап берничә тикшеренү төркеме үзләрен югары температуралы микроскопия (HTM) системаларын кертүгә багышладылар. 1994 елда Глюх һ.б. Heatingылыту / суыту камерасы анеробицитны саклап калу өчен ябылган турыпочмаклы капиллярларның температурасын контрольдә тотучы Peltier күзәнәген куллану нигезендә уйланган. Theайланма 100 ° C га кадәр 2 ° C / s температурада җылытылырга мөмкин, бу авторларга термотога маритима гипертермофил бактериясенең хәрәкәтен өйрәнергә мөмкинлек бирә. 1999 елда Горн һ.б. Күзәнәк бүленешен / тоташуны өйрәнү өчен коммерция микроскопиясе өчен яраклы җылытылган капиллярлар куллануга нигезләнеп бик охшаш җайланма эшләнде. Озак вакыт чагыштырмача актив булмаганнан соң, эффектив HTMларны эзләү 2012-нче елда яңадан башланды, аеруча Wirth төркеме кәгазьләре сериясенә бәйле рәвештә, Горн һәм башкалар уйлап тапкан җайланма кулланган. Унбиш ел элек күп санлы археа хәрәкәте, шул исәптән гипертермофиллар, 100 ° C га кадәр температурада җылытылган капиллярлар ярдәмендә өйрәнелде23,24. Алар шулай ук оригиналь микроскопны тизрәк җылытуга ирештеләр (билгеләнгән температурага 35 минут урынына берничә минут) һәм уртача 2 смнан артык сызыклы температура градиентына ирештеләр. Бу температура градиент формалаштыру җайланмасы (TGFD) 24, 25 биологик яктан ерак араларда температура градиентлары эчендә күп термофилларның хәрәкәтен өйрәнү өчен кулланылды.
Ябык капиллярларны җылыту термофилларны күзәтүнең бердәнбер ысулы түгел. 2012 елда, Кувабара һ.б. Өйдә бер тапкыр кулланыла торган Пирекс камералары җылылыкка чыдам ябыштыргыч белән мөһерләнгән (Super X2; Cemedine, Япония) кулланылды. Samрнәкләр 110 ° C кадәр җылытырга сәләтле, ләкин башта биоимиграция өчен түгел, коммерцияле ачык булган җылыту тәлинкәсенә (Микро җылылык тәлинкәсе, Китазато корпорациясе, Япония) урнаштырылган. Авторлар анаероб термофил бактерияләренең эффектив бүленешен күзәттеләр (Термосифо глобиформаннары, икеләтә 24 минут) 65 ° C. 2020 елда Пулшен һ.б. Коммерция металл савытларны эффектив җылыту (AttofluorTM, Термофишер) өйдә ясалган ике җылыту элементы ярдәмендә күрсәтелде: капка һәм этап (PCR машинасы белән эшләнгән конфигурация). Бу ассоциация бердәм сыеклык температурасына китерә һәм капка төбендәге парга әйләнүдән һәм конденсациядән саклый. О-боҗраны куллану әйләнә-тирә мохит белән газ алмашудан саклый. Сульфоскоп дип аталган бу HTM, Сульфолобус кислотасы 75 ° C27 сурәтендә кулланылган.
Бу системаларның танылган чикләнеше һава максатларын куллануны чикләү иде, мондый югары температура өчен һәм 1 мм калынлыктагы ачык үтә күренмәле үрнәкләр аша нефтькә чуму. Бу системаларның танылган чикләнеше һава максатларын куллануны чикләү иде, мондый югары температура өчен һәм 1 мм калынлыктагы ачык үтә күренмәле үрнәкләр аша нефтькә чуму. Общепризныным недостатком всех этих было ограничение на использование воздушных ока окаов, поскольку любое иммермое погружение в масло не подходило для тако вчикы? Бу системаларның танылган җитешсезлеге һава максатларын куллануны чикләү иде, чөнки нефтьне суга чумдыру андый югары температура өчен һәм ачык булмаган үрнәкләр аша 1 мм калынлыктагы визуализация өчен яраксыз иде.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适合这样的高温和通过> 1 毫米厚的透明样品成像。 Бу системаларның танылган чикләнеше - һавага кертелгән көзге куллануны чикләү, чөнки теләсә нинди майга чуму ачык үрнәкләрне> 1 мм калынлыктагы шундый югары температурада сурәтләү өчен яраксыз. Общепризнанным недостатком всех этих является ограниченное использование воздушных обанов, любое иммер аминое погружение в масло непригодно для таких вискоких зымы? Бу системаларның танылган җитешсезлеге - һава линзаларын чикләнгән куллану, теләсә нинди майга чуму андый югары температура һәм визуальләштерү өчен яраксыз үрнәкләр> 1 мм калынлыкта.Күптән түгел бу чикләү Чарльз-Орзаг һ.б. тарафыннан бетерелде. 28, ул кызыксыну системасы тирәсендә җылылык бирми торган җайланма уйлап тапты, киресенчә, пыяла эчендә, ITO (индий-калай оксиды) ясалган резисторның нечкә үтә күренмәле катламы белән капланган. Электр капкасын үтә күренмәле катлам аша үткәреп, капкачны 75 ° C кадәр җылытырга мөмкин. Ләкин автор шулай ук объектив линзаны җылытырга тиеш, ләкин аңа зыян китермәс өчен 65 ° C-тан артык түгел.
Бу әсәрләр шуны күрсәтә: югары температуралы оптик микроскопия үсеше киң кабул ителмәгән, еш кына өйдә эшләнгән җиһазлар таләп ителә, һәм еш кына киңлек резолюциясе бәясенә ирешелә, бу термофилик микроорганизмнарның берничәсеннән зур түгеллеген исәпкә алып җитди кимчелек. микрометрлар. Heatingылыту күләменең кимүе - HTM-ның өч проблемасын чишү өчен ачкыч: киңлек киңлеге, система җылытылганда югары җылылык инерциясе, һәм экстремаль температурада әйләнә-тирә элементларны зарарлы җылыту (чумдыру мае, объектив линза ... яки кулланучы кулы). ).
Бу кәгазьдә без термофил күзәтү өчен HTM тәкъдим итәбез, ул резистив җылытуга нигезләнмәгән. Киресенчә, без микроскоп өлкәсенең чикләнгән өлкәсендә локальләштерелгән җылытуга ирештек, яктылыкны үзләштерүче субстратны лазер нурлары белән. Температураның бүленеше сан фазасы микроскопиясе (QPM) ярдәмендә визуальләштерелгән. Бу ысулның эффективлыгын 65 ° C температурада тудыручы һәм кыска икеләтү вакыты булган (20 минут тирәсе) хәрәкәтчән термофил бактериясе Geobacillus stearothermophilus күрсәтә, һәм 80 ° C (арха) оптималь үскән гипертермофил Сульфолобус шибатасы. иллюстрацияләү. Нормаль кабатлау дәрәҗәсе һәм йөзү температура функциясе буларак күзәтелде. Бу лазер HTM (LA-HTM) каплагыч калынлыгы яки максатның табигате (һава яки майга чуму) белән чикләнми. Бу базардагы теләсә нинди югары резолюцияле линзаны кулланырга мөмкинлек бирә. Ул шулай ук җылылык инерциясе аркасында әкрен җылытудан азапланмый (миллисекунд шкалада тиз җылытуга ирешә) һәм коммерциядә булган компонентларны гына куллана. Куркынычсызлык өчен бердәнбер яңа проблема җайланма эчендә һәм, мөгаен, саклагыч күзлек таләп итә торган көчле лазер нурлары (гадәттә 100 мВтка кадәр) булу белән бәйле.
LA-HTM принцибы - микроскоп күренеше өлкәсендә үрнәкне җылыту өчен лазер куллану (1а рәсем). Моның өчен үрнәк яктылыкны үзләштерергә тиеш. Лазер көчен акыллы куллану өчен (100 мВттан да азрак), без сыеклыкның яктылык үзләштерүенә таянмадык, ләкин субстратны алтын нанопартиклар белән каплап, ясалма рәвештә ясалуны арттырдык (1с рәсем). Алтын нанопартикларны яктылык белән җылыту җылылык плазмоникасы өлкәсендә төп әһәмияткә ия, биомедицина, нанохимия яки кояш нурларын җыюда көтелгән кушымталар 29,30,31. Соңгы берничә ел эчендә без бу LA-HTMны физика, химия һәм биологиядә җылылык плазмасы куллану белән бәйле берничә тикшерүдә кулландык. Бу ысул белән төп кыенлык соңгы температура профилен күрсәтүдә, чөнки күтәрелгән температура үрнәк эчендә микроскаль өлкә белән чикләнә. Без күрсәттек, температура картасына дүрт дулкынлы трансверс кыргыч интерферометр, гади, югары резолюцияле һәм санлы фаз микроскопиясенең бик сизгер ысулы ярдәмендә ирешергә мөмкин, ике үлчәмле дифракцияле плиталар куллану нигезендә (шулай ук кроссовкалар дип тә атала). 33,34,35,36. Бу җылылык микроскопия техникасының ышанычлылыгы, кисешкән торле дулкынлы микроскопиягә (CGM) нигезләнеп, соңгы дистә елда бастырылган дистә кәгазьдә күрсәтелде37,38,39,40,41,42,43.
Параллель лазер җылыту, формалаштыру һәм температура микроскопы урнаштыру схемасы. b Алтын нанопартиклар белән капланган каплагыч булган AttofluorTM камерасыннан торган геометрия үрнәге. в ampleрнәкне игътибар белән карагыз (масштабларга түгел). d бердәм лазер нур профилен күрсәтә һәм (e) алтын нанопартикларның үрнәк яссылыгында симуляцияләнгән температураның бүленеше. f - (g) күрсәтелгән температураның бүленеше симуляциясендә күрсәтелгәнчә, бердәм температура тудыру өчен яраклы еллык лазер нуры профиле. Масштаб сызыгы: 30 мм.
Аерым алганда, күптән түгел без имезүчеләрнең күзәнәкләрен LA-HTM һәм CGM белән җылытуга ирештек һәм 37-42 ° C диапазонында кәрәзле җылылык шок реакцияләрен күзәттек, бу техниканың бер тере күзәнәк күзаллавына кулланылышын күрсәтеп. Ләкин, югары температурада микроорганизмнарны өйрәнүгә LA-HTM куллану бертөрле түгел, чөнки имезүчеләр күзәнәкләре белән чагыштырганда күбрәк сак булырга кирәк: беренчедән, урта төбен дистәләрчә градус җылыту (берничә градус түгел) көчле вертикаль температура градиентына. сыеклык конвекциясен барлыкка китерә ала, ул субстратка нык бәйләнмәсә, теләмәгән хәрәкәткә һәм бактерияләрнең кушылуына китерә ала. Бу конвекция сыек катлам калынлыгын киметеп бетерелергә мөмкин. Моның өчен, түбәндә китерелгән барлык экспериментларда, бактерия асылмалары металл капчык эчендә урнаштырылган якынча 15 мм калынлыктагы ике каплагыч арасында урнаштырылды (AttofluorTM, Термофишер, рәсем 1б, с). Принципта, сыеклыкның калынлыгы җылыту лазерының нур зурлыгыннан кечерәк булса, конвекциядән сакланырга мөмкин. Икенчедән, мондый чикләнгән геометриядә эшләү аэробик организмнарны тынычландырырга мөмкин (карагыз, С2 рәсем). Бу проблема кислородка (яки бүтән мөһим газга) үтеп керә торган субстратны кулланып, капланган һава күбекләрен каплагыч эчендә калдырып яки өске каплагычтагы тишекләрне бораулап (S1 рәсемне кара) 45. Бу тикшеренүдә без соңгы чишелешне сайладык (Рәсемнәр 1б һәм С1). Ниһаять, лазер җылыту бердәм температураны таратуны тәэмин итми. Лазер нурының шул ук интенсивлыгында (1-нче рәсем), температураның бүленеше бертөрле түгел, киресенчә, җылылык диффузиясе аркасында Гаос бүленешенә охшаган (1-нче рәсем). Максат биологик системаларны өйрәнү өчен төгәл температура булдыру булганда, тигез булмаган профильләр идеаль түгел һәм субстратка ябышмасалар, бактерияләрнең термофоретик хәрәкәтенә китерергә мөмкин (S3, S4 рәсемен кара) 39. Бу максаттан, без геометрик өлкәдә температураның бертөрле таралышына ирешү өчен, үрнәк яссылыгында боҗра формасына (1-нче рәсем) инфракызыл лазер нурын формалаштыру өчен киңлек яктылык модульаторы (SLM) кулландык, Термаль диффузиягә карамастан (1д рәсем) 39, 42, 46 Бу өске каплагыч мөһерләнмәгәнгә, кирәк булганда өстәмә медиа теләсә кайсы вакытта җиңел өстәлергә мөмкин.
LA-HTM ничек эшләвен һәм термофилик тикшеренүләрдә кулланылышын күрсәтү өчен, без 60-65 ° C тирәсе оптималь үсеш температурасы булган Geobacillus stearothermophilus аэроб бактерияләрен өйрәндек. Бактерия шулай ук флагелла һәм йөзү сәләтенә ия, гадәти кәрәзле эшчәнлекнең тагын бер күрсәткече.
Plesрнәкләр (1б рәсем) 60 ° C тәүлек эчендә инкубацияләнде, аннары LA-HTM үрнәк хуҗасына урнаштырылды. Бу инкубация алдыннан факультатив, ләкин һаман да файдалы, ике сәбәп аркасында: Беренчедән, лазер кабызылгач, ул күзәнәкләрнең тиз арада үсүенә һәм бүленүенә китерә (өстәмә материалларда M1 киносын карагыз). Инкубация алдыннан, бактерия үсеше гадәттә үрнәк буенча яңа карау өлкәсе җылытылган саен якынча 40 минутка тоткарлана. Икенчедән, инкубациягә кадәр 1 сәгать бактерияләрнең каплагычка ябышуына ярдәм итте, лазер кабызылганда термофорез аркасында күзәнәкләрнең күз кырыннан чыгуына юл куймады (өстәмә материалларда M2 фильмын карагыз). Термофорез - кисәкчәләрнең яки молекулаларның температура градиенты буенча хәрәкәте, гадәттә кайнардан салкынга кадәр, һәм бактерияләр дә читтә калмый 43,47. Бу теләмәгән эффект, лазер нурын формалаштыру һәм яссы температураны таратуга ирешү өчен, SLM ярдәмендә билгеле бер өлкәдә бетерелә.
Инҗирдә. 2 нче рәсемдә алтын нанопартиклар белән капланган пыяла субстратны еллык лазер нуры белән нурландырылган CGM белән үлчәнгән температураның бүленеше күрсәтелгән (1ф рәсем). Тигез температураның бүленеше лазер нуры белән капланган бөтен мәйданда күзәтелде. Бу зона 65 ° C, оптималь үсеш температурасы итеп билгеләнде. Бу төбәктән тыш, температура сызыгы табигый рәвештә \ (1 / r \) төшә (монда \ (r \) радиаль координатасы).
CGM үлчәүләренең Температура картасы, түгәрәк мәйдан өстендә яссы температура профиле алу өчен, алтын нанопартиклар катламын нурландыру өчен еллык лазер нуры ярдәмендә алынган. b Температура картасының изотермасы (а). Лазер нурының контуры соры нокталы түгәрәк белән күрсәтелә. Эксперимент ике тапкыр кабатланды (өстәмә материаллар, рәсем S4).
LA-HTM ярдәмендә бактерия күзәнәкләренең яшәешлелеге берничә сәгать контрольдә тотылды. Инҗирдә. 3 3 сәгать 20 минутлык кинодан алынган дүрт рәсем өчен вакыт аралыгын күрсәтә (M3 кино, өстәмә мәгълүмат). Бактерияләр температура оптималь булган лазер белән билгеләнгән түгәрәк мәйданда актив таралу күзәтелә, 65 ° C ка якынлаша. Киресенчә, температура 10 с өчен 50 ° C-тан түбән төшкәч, күзәнәк үсеше сизелерлек кимеде.
Төрле вакытта лазер җылытылганнан соң үскән Г. стереотермофил бактерияләренең оптик тирәнлек рәсемнәре, а) т = 0 мин, б) 1 с 10 мин, (в) 2 с 20 мин, (г) 3 с 20 мин. 200 Бер минутлык фильмнан алынган (Өстәмә мәгълүматта бирелгән M3 фильмы) тиешле температура картасында урнаштырылган. Лазер вакытында кабызыла \ (t = 0 \). Изотермалар интенсивлык образына өстәлде.
Күзәнәкнең үсешен һәм аның температурага бәйләнешен тагын да бәяләү өчен, без M3 кино кырында башта изоляцияләнгән бактерияләрнең төрле колонияләренең биомассасының үсешен үлчәдек (4 нче рәсем). Мини колония формалаштыру берәмлеге (mCFU) формалашу башында сайланган ата-аналар бактерияләре С6-нчы рәсемдә күрсәтелгән. Коры масса үлчәүләре CGM 48 камерасы белән алынды, алар температураны бүлү картасын кулландылар. CGMның коры авырлыкны һәм температураны үлчәү сәләте LA-HTM көче. Көтелгәнчә, югары температура бактерияләрнең тиз үсүенә китерде (4а рәсем). 4б рәсемдәге ярым бүрәнә сюжетында күрсәтелгәнчә, барлык температураларда үсеш экспоненциаль үсештән тора, монда мәгълүмат экспоненциаль функцияне куллана \ (m = {m} _ {0} {10} ^ {t / \ tau} + {{\ mbox {cst}}} \), монда \ (\ tau {{{{{\ rm {log}}}}}} 2 \) - буын вакыты (яки икеләтә вакыт), \ (g = 1 / \ tau \) - үсеш темплары (берәмлек вакытына бүленешләр саны). Инҗирдә. 4c температура функциясе буларак тиешле үсеш темпларын һәм буын вакытын күрсәтә. Тиз үсә торган mCFUлар ике сәгатьтән соң үсешнең туенуы, югары бактерия тыгызлыгы аркасында көтелгән тәртип (классик сыек культураларда стационар этапка охшаган) белән аерылып торалар. Гомуми форма \ (g \ сул (T \ уң) \) (4с рәсем) Г. стереотермофил өчен оптималь үсеш темплары 60-65 ° C тирәсендә көтелгән ике фазалы сызыкка туры килә. Кардинал модель ярдәмендә мәгълүматны туры китерегез (S5 рәсем) 49 монда \ (\ сул ({{G} _ {0} {; \; T}} _ {{\ min}}; {T} _ {{opt}}) ; {T} _ {{\ max}} \ уң) \) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) ° C, бу әдәбиятта китерелгән башка кыйммәтләр белән яхшы килешә49. Температурага бәйле параметрлар кабат чыгарылса да, максималь үсеш темплары \ ({G} _ {0} \) бер эксперименттан икенчесенә кадәр булырга мөмкин (S7-S9 рәсемнәрен һәм M4 киносын карагыз). Универсаль булырга тиешле температураны урнаштыру параметрларыннан аермалы буларак, максималь үсеш темплары күзәтелгән микроскаль геометрия эчендә уртача (туклыклы матдәләр, кислород концентрациясе) үзлекләренә бәйле.
төрле температурада микробиаль үсеш. mCFU: Миниатюр колония формалаштыру берәмлекләре. Температура градиентында үсә торган бер бактерия видеосыннан алынган мәгълүматлар (кино M3). b (а) кебек үк, ярым-логарифмик масштаб. в rateсеш темплары \ (\ tau \) һәм буын вакыты \ (g \) сызыклы регрессиядән исәпләнә. Горизонталь хата барлары: температура диапазоны, аның өстендә mCFUлар үсеш өлкәсенә киңәеп киттеләр. Вертикаль хата барлары: сызыклы регрессия стандарт хата.
Нормаль үсешкә өстәп, кайбер бактерияләр кайвакыт лазер җылыту вакытында йөзеп йөриләр, бу флагелла белән бактерияләр өчен көтелгән тәртип. Өстәмә мәгълүматта M5 киносы мондый йөзү чараларын күрсәтә. Бу экспериментта 1d, e һәм S3 рәсемнәрендә күрсәтелгәнчә, температура градиентын булдыру өчен бердәм лазер нурлары кулланылды. 5 нче рәсемдә M5 фильмыннан сайланган ике рәсем эзлеклелеге күрсәтелә, бер бактерия юнәлешле хәрәкәтне күрсәтә, калган барлык бактерияләр хәрәкәтсез кала.
Ике вакыт рамкалары (а) һәм (б) нокталы түгәрәкләр белән билгеләнгән ике төрле бактериянең йөзүен күрсәтәләр. Рәсемнәр M5 фильмыннан алынган (өстәмә материал буларак бирелгән).
Г. стереотермофилус очракта, бактерияләрнең актив хәрәкәте (5 нче рәсем) лазер нуры кабызылганнан соң берничә секундтан башланды. Бу күзәтү бу термофилик микроорганизмның температураның күтәрелүенә вакытлыча җавап бирә, Мора һ.б. күзәткәнчә. 24. LA-HTM ярдәмендә бактерия хәрәкәте һәм хәтта термотаксис темасын тагын да өйрәнеп була.
Микробиаль йөзү башка физик хәрәкәт төрләре белән буталырга тиеш түгел, ягъни (i) билгеле юнәлешсез хаотик хәрәкәт булып күренгән Браун хәрәкәте, (ii) 50 конвекция һәм термофорез 43, температура буенча даими хәрәкәттән торган. градиент.
Г. стереотермофилус әйләнә-тирә мохитнең начар шартларына сакланганда, бик чыдам споралар (спор формалашуы) җитештерү сәләте белән билгеле. Экологик шартлар яңадан уңайлангач, споралар үсә, тере күзәнәкләр барлыкка килә һәм үсешне дәвам итә. Бу споруляция / үсемлек процессы яхшы билгеле булса да, ул реаль вакытта беркайчан да күзәтелмәгән. LA-HTM кулланып, без монда Г. стереотермофилда үсемлек вакыйгаларының беренче күзәтүен хәбәр итәбез.
Инҗирдә. 6а 13 спорадан торган CGM җыелмасы ярдәмендә алынган оптик тирәнлекнең (ОТ) вакыт аралыгын күрсәтә. Collectionыю вакыты өчен (15 с 6 мин, \ (t = 0 \) - лазер белән җылыту башы), 13 спораның 4е бер-бер артлы вакыт нокталарында үсеп чыкты \ (t = 2 \) h, \ (3 \ ) h \ (10 \) ', \ (9 \) h \ (40 \)' һәм \ (11 \) h \ (30 \) '. Бу вакыйгаларның берсе генә 6-нчы рәсемдә күрсәтелсә дә, өстәмә материалда M6 киносында 4 үсемлек вакыйгасын күзәтергә мөмкин. Кызык, үсү очраклы булып күренә: барлык споралар да үсми һәм бер үк вакытта үсми, экологик шартларның бер үк үзгәрүенә карамастан.
8 ОТ рәсемнәреннән торган вакыт аралыгы (нефтькә чуму, 60х, 1,25 НА максаты) һәм б) Г. стереотермофил агрегатларының биомассасы эволюциясе. в) үсеш темпының сызыклылыгын күрсәтү өчен ярым бүрәнә шкаласында сызылган.
Инҗирдә. 6b, c мәгълүмат җыю чорында вакыт функциясе буларак күзаллау өлкәсендә күзәнәк популяцияләренең биомассасын күрсәтә. Инҗирдә \ (t = 5 \) с күзәтелгән коры массаның тиз бозылуы. 6б, с, кайбер күзәнәкләрнең күренеш кырыннан чыгуы аркасында. Бу дүрт вакыйганың үсеш темплары \ (0.77 \ pm 0.1 \) h-1. Бу кыйммәт 3 һәм 4 нче рәсемнәр белән бәйле үсеш темпларыннан югарырак, анда күзәнәкләр нормаль үсә. Споралардан Г. стереотермофилусның үсеш темпларының артуы сәбәбе аңлашылмый, ләкин бу үлчәүләр LA-HTM кызыксынуын күрсәтәләр һәм күзәнәк тормышы динамикасы турында күбрәк белү өчен бер күзәнәк дәрәҗәсендә (яки бер mCFU дәрәҗәсендә) эшлиләр. .
LA-HTMның күпкырлы булуын һәм аның югары температурада эшләвен күрсәтү өчен, без оптималь үсеш температурасы 80 ° C51 булган гипертермофил кислотасы филик археа Сульфолобус шибате үсешен тикшердек. Г. стереотермофилус белән чагыштырганда, бу археа шулай ук бик төрле морфологиягә ия, озын таякларга (бакилли) түгел, 1 микрон сферага охшаган.
Рәсем 7а CGM ярдәмендә алынган S. shibatae mCFU эзлекле оптик тирәнлек рәсемнәреннән тора (өстәмә материалларда M7 фильмын карагыз). Бу mCFU оптималь температура 80 ° C астыннан 73 ° C тирәсендә үсә, ләкин актив үсеш өчен температура диапазонында. MCFUларны берничә сәгатьтән соң археа микрограпларына охшаткан берничә ярылу вакыйгаларын күзәттек. Бу OT рәсемнәреннән mCFU биомассасы вакыт белән үлчәнде һәм 7б рәсемдә күрсәтелде. Кызык, S. shibatae mCFUs Г. стереотермофил mCFUs белән күрелгән экспоненциаль үсешне түгел, ә сызыклы үсешне күрсәттеләр. Күзәнәкнең үсеш темпларының табигате турында күптәнге бәхәс 52 булды: кайбер тикшеренүләр микробларның үсеш темпларына хәбәр итәләр, аларның зурлыгына пропорциональ (экспоненциаль үсеш), икенчеләре даими темпны күрсәтәләр (сызыклы яки билинар үсеш). Zур һәм башкалар белән аңлатылганча, экспоненциаль һәм (би) сызыклы үсешне аеру биомассаны үлчәүдә төгәллекне таләп итә, бу күпчелек QPM техникасына, хәтта интерферометриягә дә кагыла. Zур һәм башкалар белән аңлатылганча, экспоненциаль һәм (би) сызыклы үсешне аеру биомассаны үлчәүдә төгәллекне таләп итә, бу күпчелек QPM техникасына, хәтта интерферометриягә дә кагыла. Как ояяснили Цур и др.53, различение зононен чинного и (би) кигого роста требует точности <6% в измерениях биомассы, что недостижимо для большинствааов QPM, даже с спрпчовы. Zur et al.53 аңлатканча, экспоненциаль һәм (би) сызыклы үсешне аеру биомассаны үлчәүдә <6% төгәллек таләп итә, бу күпчелек QPM ысуллары өчен, хәтта интерферометрия ярдәмендә дә мөмкин түгел.Зур һәм башкалар аңлатканча. 53, экспоненциаль һәм (би) сызыклы үсешне аеру биомассаны үлчәүдә 6% тан төгәллек таләп итә, бу күпчелек QPM ысуллары өчен, хәтта интерферометрия кулланылса да. CGM бу төгәллеккә биомасс үлчәүләрендә sub-pg төгәллеге белән ирешә36,48.
6 ОТ рәсемнәреннән торган вакыт аралыгы (нефтькә чуму, 60х, NA максаты 1.25) һәм (б) CGM белән үлчәнгән микро-CFU биомассасы эволюциясе. Күбрәк мәгълүмат алу өчен M7 фильмын карагыз.
С.Шибатаның камил сызыклы үсеше көтелмәгән иде һәм әле хәбәр ителмәгән. Ләкин, экспоненциаль үсеш көтелә, ким дигәндә, чөнки вакыт узу белән 2, 4, 8, 16… күзәнәкләрнең берничә бүленеше булырга тиеш. Без фаразладык, сызыклы үсеш тыгыз күзәнәк төрү аркасында күзәнәкнең тыелуы аркасында булырга мөмкин, күзәнәкнең үсеше акрыная һәм ахыр чиктә күзәнәк тыгызлыгы артык булганда йокыга китә.
Без үз чиратында түбәндәге биш кызыксыну пункты турында сөйләшеп тәмамлыйбыз: җылыту күләмен киметү, җылылык инерциясен киметү, алтын нанопартикларга кызыксыну, сан фазасы микроскопиясенә кызыксыну, һәм LA-HTM кулланырга мөмкин булган температура диапазоны.
Резистив җылыту белән чагыштырганда, HTM үсеше өчен кулланылган лазер җылыту берничә өстенлек тәкъдим итә, без бу тикшерүдә күрсәтәбез. Аерым алганда, микроскоп өлкәсендә сыек массакүләм мәгълүмат чараларында җылыту күләме берничә (10 μm) 3 том эчендә саклана. Шул рәвешле, күзәтелгән микроблар гына актив, бүтән бактерияләр йокысыз һәм үрнәкне өйрәнү өчен кулланырга мөмкин - яңа температураны тикшергән саен үрнәкне үзгәртергә кирәкми. Моннан тыш, микроскаль җылыту зур температураны турыдан-туры тикшерергә мөмкинлек бирә: 4c рәсем 3 сәгатьлек кинодан алынган (M3 кино), бу гадәттә берничә үрнәк әзерләү һәм тикшерүне таләп итә - өйрәнелә торган үрнәкләрнең һәрберсе өчен. y - эксперименттагы көн санын күрсәтүче температура. Atedылытылган күләмне киметү шулай ук микроскопның әйләнә-тирәдәге оптик компонентларын, аеруча объектив линзаны бүлмә температурасында саклый, бу әлегә җәмгыять алдында торган төп проблема. LA-HTM теләсә нинди линза белән кулланылырга мөмкин, шул исәптән майга чуму линзалары, һәм хәтта экстремаль температура белән дә бүлмә температурасында калачак. Бу тикшеренүдә хәбәр иткән лазер җылыту ысулының төп чикләнеше - ябышмаган яки йөзмәүче күзәнәкләр күренеш өлкәсеннән ерак булырга һәм өйрәнү авыр булырга мөмкин. Берничә йөз микроннан артып, температураның зуррак күтәрелүенә ирешү өчен, зурлау линзаларын куллану булырга мөмкин. Бу саклык киңлек резолюциясенең кимүе белән бергә бара, ләкин максат микроорганизмнар хәрәкәтен өйрәнү булса, югары киңлек резолюциясе таләп ителми.
Системаны җылыту (һәм суыту) вакыт масштабы \ ({{{{r \ rm {\ tau}}}}}}} _ {{{\ mbox {D}}}} \) аның зурлыгына бәйле, закон буенча \ ({{{{ (L \) - җылылык чыганагының характеристик зурлыгы (безнең тикшерүдә лазер нурының диаметры \ (L \ якынча 100 \) μm), \ (D \) - әйләнә-тирә мохитнең җылылык диффузиясе. очрак, пыяла һәм су Диффузия дәрәҗәсе \ (D \ якынча 2 \ fold {10} ^ {- 7} \) m2 / s) Шуңа күрә, бу тикшеренүдә, 50 мс тәртибенең вакыт җаваплары, ягъни квази-мизгел температура үзгәрүен көтеп була, температураның тиз арада күтәрелүе эксперимент вакытын кыскартып кына калмый, шулай ук температура эффектларын динамик өйрәнү өчен төгәл вакытны \ (t = 0 \) бирә.
Безнең тәкъдим ителгән ысул теләсә нинди яктылык сеңдерүче субстратка кагыла (мәсәлән, ITO каплавы белән коммерция үрнәкләре). Ләкин, алтын нанопартиклар инфракызылда югары үзләштерүне һәм күренеп торган диапазонда түбән үзләштерүне тәэмин итә ала, соңгы характеристикалары күренгән диапазонда оптик күзәтү өчен кызыклы, аеруча флюоресенция кулланганда. Моннан тыш, алтын биокомпонентлы, химик инерт, оптик тыгызлык 530 нмнан инфракызылга кадәр көйләнергә мөмкин, һәм үрнәк әзерләү гади һәм экономияле29.
Трансфер торлы дулкын фронт микроскопиясе (CGM) микроскаль температураны картага китерергә генә түгел, биомассаны мониторингларга да мөмкинлек бирә, бу LA-HTM белән берлектә аеруча файдалы (кирәк булмаса). Соңгы дистә ел эчендә башка температура микроскопия техникасы эшләнде, аеруча биоимиграция өлкәсендә, һәм аларның күбесе температурага сизгер флуоресцент пробалар куллануны таләп итә54,55. Ләкин, бу ысуллар тәнкыйтьләнде һәм кайбер докладлар күзәнәкләр эчендә реаль булмаган температураның үзгәрүен үлчәделәр, мөгаен, флуоресенция температурадан башка күп факторларга бәйле. Моннан тыш, күпчелек флуоресцент зоналар югары температурада тотрыксыз. Шуңа күрә QPM һәм аеруча CGM оптик микроскопия ярдәмендә югары температурада тормышны өйрәнү өчен идеаль температура микроскопия техникасын күрсәтәләр.
80 ° C оптималь яшәгән С.Шибата тикшеренүләре шуны күрсәтә: LA-HTM гади термофиллар гына түгел, гипертермофилларны өйрәнү өчен кулланыла ала. Принципта, LA-HTM ярдәмендә ирешеп була торган температура диапазонына чик юк, һәм хәтта 100 ° C тан артык температура кайнап тормыйча, атмосфера басымына барып җитә ала, безнең группа 38 атмосферада гидротермик химия кушымталарында күрсәткәнчә. басым A. Алтын нанопартикларны 40 җылыту өчен лазер кулланыла. Шулай итеп, LA-HTM стандарт шартларда (ягъни экологик стресс астында) стандарт югары резолюцияле оптик микроскопия белән күрелмәгән гипертермофилларны күзәтү өчен кулланыла ала.
Барлык экспериментлар да өйдә ясалган микроскоп ярдәмендә үткәрелде, шул исәптән Көлер яктырту (LED, M625L3, Торлабс, 700 мВт), кул белән x хәрәкәте булган үрнәк тотучы, максатлар (Олимп, 60x, 0.7 NA, һава, LUCPlanFLN60X яки 60x, 1.25 NA, Oil , UPLFLN60XOI), CGM камерасы (QLSI кроссовкасы, 39 мм тишек, Андор Зила камера сенсорыннан 0,87 мм), интенсивлык һәм дулкын кыры күзаллау өчен, һәм sCMOS камерасы (ORCA Flash 4.0 V3, 16 битлы режим, Хамаматсудан). 5 нче рәсемдә күрсәтелгән мәгълүматлар (бактерияле йөзү). Дикрой нур бүлүче - 749 нм BrightLine кыры (Семрок, FF749-SDi01). Камера алдындагы фильтр - 694 кыска пассажир фильтры (FF02-694 / SP-25, Семрок). Титан сапфир лазеры (Лазер Верди G10, 532 нм, 10 Вт, насос цунами лазер куышлыгы, 2-5 нче рәсемдә спектра-физика, алга таба Милления лазеры, Спектрафизика 10 Вт, Мира лазер куышлыгы, Коерент, 2 нче рәсем өчен. -5). 6 һәм 7) дулкын озынлыгына куелган \ ({{{({\ rm {\ lambda}}}}}} = 800 \) nm, бу алтын нанопартикларның плазмон резонанс спектрына туры килә. Мейкин яктылык модульаторлары (1920 × 1152 пиксель) Meadowlark Optics-тан сатып алынган, голограммалар 39-нчы сылтамада күрсәтелгәнчә Герчберг-Саксон алгоритмы ярдәмендә исәпләнде.
Кросс тортлы дулкынлы микроскопия (CGM) - оптик микроскопия техникасы, гадәти камера сенсорыннан бер миллиметр ераклыкта ике үлчәмле дифракцияле торуны (кросс торлау дип тә атала) берләштерүгә нигезләнгән. Бу тикшеренүдә кулланган CGM-ның иң еш очрый торган мисалы дүрт дулкынлы трансверт смена интерферометры (QLSI) дип атала, монда кросс-торлау Primot hәм кертелгән һәм патентланган интенсивлык / фаза тикшерү тактасы үрнәгеннән тора. Вертикаль һәм горизонталь торлау линияләре сенсорда челтәргә охшаган күләгәләр тудыралар, аларның бозылуы реаль вакытта санлы рәвештә эшкәртелергә мөмкин, оптик дулкын кыры бозылу (яки эквивалент фаз профиле). Микроскопта кулланылганда, CGM камерасы нанометрлар тәртибендә сизгерлек белән оптик тирәнлек (ОТ) дип аталган сурәтләнгән объектның оптик юл аермасын күрсәтә ала. Теләсә нинди CGM үлчәвендә, оптик компонентлардагы яки балкышлардагы кимчелекләрне бетерү өчен, төп OT рәсеме алынырга һәм алдагы рәсемнәрдән алынырга тиеш.
Температура микроскопиясе белешмәлектә күрсәтелгәнчә CGM камерасы ярдәмендә башкарылды. Кыскасы, сыеклыкны җылыту аның реактив индексын үзгәртә, җылылык линзасы эффектын барлыкка китерә. Бу дулкын кыры бозылуы CGM белән үлчәнә һәм сыек шартларда өч үлчәмле температураны тарату өчен деконволюция алгоритмы ярдәмендә эшкәртелә. Әгәр дә алтын нанопартиклар бөтен үрнәк буенча тигез таратылса, температураны картография бактериясез өлкәләрдә яхшырак сурәтләр ясау өчен ясарга мөмкин, бу без кайвакыт эшлибез. CGM рәсеме җылытылмыйча алынган (лазерны сүндереп) һәм соңыннан шул ук урында лазер белән төшерелгән.
Коры масса үлчәү температураны күзәтү өчен кулланылган шул ук CGM камерасы ярдәмендә ирешелә. CGM сылтама рәсемнәре бактерияләр булу сәбәпле, ОТтагы бертөрле булмаганлыкны уртача куллану чарасы буларак экспозиция вакытында х һәм у үрнәкләрен тиз күчереп алынган. Бактерияләрнең OT рәсемнәреннән, аларның биомассасы Матлабның өйдә ясалган сегментлаштыру алгоритмы ярдәмендә сайланган өлкәләр буенча рәсемнәр ансамбле ярдәмендә алынган ("Сан коды" бүлеген карагыз), реформада күрсәтелгән процедура буенча. Кыскасы, без бәйләнешне кулланабыз \ (m = {\ alfa} ^ {- 1} \ iint {{\ mbox {OT}}} \ сул (x, y \ уң) {{\ mbox {d}} } x {{\ mbox {d}}} y \), монда \ ({{\ mbox {OT}} left \ сул (x, y \ уң) \) оптик тирәнлек образы, \ (m \) коры авырлык һәм \ ({{{{{\ rm {\ alfa}}}}}}) даими. Без \ ({{{{\ rm {\ alfa)))))) = 0.18 \) µm3 / pg сайладык, бу тере күзәнәкләр өчен гадәти даими.
25 мм диаметрлы һәм 150 мм калынлыктагы алтын нанопартиклар белән капланган каплагыч AttofluorTM камерасына (Термофишер) алтын нанопартиклар өскә куелган. Geobacillus stearothermophilus экспериментларның һәр көненә кадәр LB уртада (200 әйләнеш, 60 ° C) төнлә эшкәртелде. Алтын нанопартиклар белән капланган слайдка оптик тыгызлык (ОД) 0,3 - 0,5 булган Г. Аннары, диаметры 18 мм булган түгәрәк каплагыч, үзәгендә диаметры 5 мм булган тишеккә ташланды, һәм шул ук оптик тыгызлыктагы 5 μл бактерия асылмасы тишек уртасына берничә тапкыр кулланылды. Каплагычтагы скважиналар реформада күрсәтелгән тәртип буенча әзерләнгән. 45 (тулырак мәгълүмат өчен өстәмә мәгълүматны карагыз). Аннары сыек катламның кипмәсен өчен каплагычка 1 мл ЛБ уртача кушыгыз. Соңгы каплагыч Attofluor ™ камерасының ябык капкасына куелган, инкубация вакытында уртача парга әйләнмәсен өчен. Чәчү экспериментлары өчен без споралар кулландык, алар гадәти экспериментлардан соң кайвакыт өске каплагычны капладылар. Сульфолобус шибатасын алу өчен шундый ук ысул кулланылды. Өч көн (200 әйләнеш, 75 ° C) Тиобацилл серратын беренчел эшкәртү 182 уртада (DSMZ) үткәрелде.
Алтын нанопартикларның үрнәкләре микельлар блок кополимер литографиясе белән әзерләнгән. Бу процесс бүлектә җентекләп тасвирланган. Кыскасы, алтын ионнарын каплаучы микельлар кополимерны HAuCl4 белән толуенда кушып синтезланган. Чистартылган каплагычлар эремәгә чумдылар һәм алтын орлыклар алу өчен киметүче агент булганда УВ нурлары белән эшкәртелде. Ниһаять, алтын орлыклар 16 минут эчендә KAuCl4 һәм этаноламин су эремәсе белән каплагычка мөрәҗәгать итеп үстерелде, нәтиҗәдә инфракызылда сферик булмаган алтын нанопартикларның квази-периодик һәм бик бертөрле урнашуы барлыкка килде.
Интерферограммаларны ОТ рәсемнәренә әверелдерү өчен, без өйдә ясалган алгоритм кулландык, сылтамада күрсәтелгәнчә. 33 һәм түбәндәге җәмәгать складында Matlab пакеты буларак кулланыла: https://github.com/baffou/CGMprocess. Пакет интенсивлыкны һәм OT рәсемнәрен язылган интерферограммаларга (белешмә рәсемнәрне кертеп) һәм камера массивы дистанцияләренә нигезләнеп исәпли ала.
Бирелгән температура профилен алу өчен SLM өчен кулланылган фаза үрнәген исәпләү өчен, без алдан эшләнгән алгоритмны кулландык39,42, ул түбәндәге җәмәгать складында бар: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Керү - кирәкле температура кыры, аны санлы яки монохром бмп рәсеме аша куеп була.
Күзәнәкләрне сегментлау һәм аларның коры авырлыгын үлчәү өчен, без үзебезнең Матлаб алгоритмын кулландык: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Eachәрбер рәсемдә кулланучы бактерияләргә яки кызыклы mCFUга басарга, таякның сизгерлеген көйләргә һәм сайлауны расларга тиеш.
Өйрәнү дизайны турында күбрәк мәгълүмат алу өчен, бу мәкалә белән бәйләнгән Табигатьне тикшерү отчетын карагыз.
Бу тикшеренү нәтиҗәләрен раслаучы мәгълүматлар тиешле сорау буенча тиешле авторлардан бирелә.
Бу тикшеренүдә кулланылган чыганак коды Методлар бүлегендә җентекләп аңлатылган, һәм төзәтү версияләрен https://github.com/baffou/ сайтыннан күчереп алырга мөмкин: SLM_temperatureShaping, CGMprocess, CGM_magicWandSegmentation.
Мехта, Р., Сингал, П., Сингх, Х., Дамл, Д. & Шарма, АК Термофилларга күзәтү һәм аларның киң спектрлы кулланмалары. Мехта, Р., Сингал, П., Сингх, Х., Дамл, Д. & Шарма, АК Термофилларга күзәтү һәм аларның киң спектрлы кулланмалары.Мехта, Р., Сингал, П., Сингх, Х., Дамл, Д. һәм Шарма, АК Термофилларга күзәтү һәм аларның киң кулланылышы. Мехта, Р., Сингал, П., Сингх, Х., Дамл, Д. & Шарма, АК 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Мехта, Р., Сингал, П., Сингх, Х., Дамл, Д. & Шарма, АК.Мехта Р., Сингал П, Сингх Х., Дэмл Д. һәм Шарма АК Термофилларны тирәнтен аңлау һәм кулланмаларның киң ассортименты.3 Биотехнология 6, 81 (2016).
Пост вакыты: 26-2022 сентябрь